A következő műszaki jelentés, a Saccharomyces cerevisiae sejtek teljes sejtkivonatának készítése a Retsch MM301 Ball Malom segítségével, 2005. augusztus 24-én jelent meg.
Cell felkészítés
Gyűjtsön 2 liter sejtet, amely közép- és késői logfázisba nőtt, 15 percig 6,000 g-os forgással. A sejteket kétszer mossa le hűtött puffer AGK-val. Becsülje meg a sejtpellet mennyiségét, és adjon hozzá 0,4 térfogat hűtött AGK-t. Vortex, hogy vastag sejtszuszpenziót készítsen. Adjon hozzá proteáz gátló koktélt 1x végső koncentrációjához. Adjuk hozzá a felfüggesztést egy 50 ml-es, folyékony nitrogénnel töltött konikához, pipettával vagy tűvel ellátott fecskendővel. Hagyjuk néhány másodpercig a cseppek között, hogy megfelelően fagyasszanak. Töltse fel a folyékony nitrogént, ha szükséges, és ne feledje, hogy többször szúrja meg a sapkát tűvel, vagy felrobban! A fagyasztott pelleteket ezután -80 °C-on tárolhatja, amíg folytatni akar.
Milling a kivonat
A Malom futtatása előtt töltse fel a tartályokat egy kis vízzel (nincs golyó! A tartályokat a golyóval, de egy szilárd minta nélkül, a tartály tönkreteszi a tartályt) és futtatja a Malomot rövid ideig 30 Hz-ben, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a tartályban lévő Teflon O gyűrű még mindig hatékony tömítést hoz létre. Használja a 25 mm-es vagy 30 mm-es golyókat a pellet mennyiségétől függően, ha a tartály túl tele van, a mintát nem fogják hatékonyan megmászni. Általában egy 2 l-es betakarítás eredményeként kb. 5 ml-es pellet és 2 ml AGK puffer keletkezik. A 7 ml-es fagyasztott cellás felfüggesztés kényelmesen illeszkedik a 30 mm-es golyóhoz a 50 ml-es pellet tartályban (a sejtek betöltik a tartály alsó felét, 1. ábra). Ha csak egy mintát fagyasztanak, használja a második üres tartályt (gömb nélkül).
A porított sejtek feldolgozása teljes sejtek kivonatához
A porot gyorsan és teljesen (kézi keveréssel) 25° - 30°-os fürdőben olvadjuk, majd jégre helyezzük. 4°-on 17K 30 percet forgassunk egy SS34 rotorban. A pellet és a lipoprotein Rétegfelület elkerülése érdekében a szupernatant egy ultra-centrifugáló csőbe helyezzük. 1 órán át 100 000 g-os hőmérsékleten forgassuk. Ismét, miközben elkerüljük a lipoprotein Rétegfelület és a pelletet, 5 percig távolítsuk el a középső Rétegfelület. Kétszer dializáljuk a csőben, molekulatömeg-vágással, 1,5 órán át 4°C-on, 2 l tampon D ellen (az eljárás felülvizsgálata Stevens és Abelson, 2002).
3. ábra. A Retsch MM301 Ball Malom által megszakított sejtekből előállított kivonatok összehasonlíthatók a morzsa és a malom által megszakított sejtekből előállítottakkal. Ugyanazt a élesztő törzset párhuzamosan dolgozták fel, az egyetlen különbség pedig a sejtek megszakításának módszere volt. A sejtek megszakítását vagy kézzel, morzsa és malom segítségével, vagy öt 3 perces ciklusban végezték el a Retsch MM301 Ball Malomban. B. A sejtek 10, 20 vagy 30 Hz-es mennyiségű hígítását egy 100X-es objektívum alatt figyelték meg, közvetlenül a megszakítás után. A sejtek mindegyikének mintázási hatékonysága a sejtek 10 fokozatú aggregációjával kezdődött.
Megjegyzések és kritikus paraméterek
- A malom és malom által megszakított sejtekkel párhuzamosan előállított extraktumok malomolási aktivitása (a 10 Hz-es frekvenciánál) hasonló malomolási aktivitással rendelkezik (3.A ábra), ami azt jelzi, hogy az RNS, valamint a fehérje a golyómalmon feldolgozása után érintetlen és aktív marad. A malomolási ciklusok 5 ciklusról 8 vagy 10 ciklusra történő növelése nem növeli a malomolási hatékonyságot (az adatok nem jelennek meg). A Malom által okozott cellamegszakítás gyorsabb, kevésbé munkaigényes és reprodukálhatóbb, mint a malom és malom által okozott cellamegszakítás.
- A 10 Hz-nél magasabb hőmérsékleten megszakított sejtekből készült kivonatok csökkenő splicing aktivitást mutatnak (3. ábra). Más élesztő laboratóriumokban azonban arról számoltak be, hogy 30 Hz-es hőmérsékleten használják a golyós Malomot immunprecipitáció céljára (lásd a Marcus Kalkum protokollját, amely a Retsch-től kapható). Javasoljuk, hogy új alkalmazásokhoz különböző marási időket és sebességeket próbáljanak ki.
- Figyelembe kell venni, hogy a 3A ábra a 20 Hz-es hőmérsékleten darált sejtekből készült kivonat szűkebb mRNA sávot mutat, ami a többi kivonattal összehasonlítva csökkent poliA aktivitásnak tudható be. Ez a tendencia nem reprodukálódott összehasonlítható vizsgálatban más törzsekkel. A 3 ábra mRNA-szintjében megfigyelt különbségek arra utalnak, hogy a sejtek megszakításának változatos módszerei kissé eltérő biokémiai tulajdonságokkal rendelkező kivonatokhoz vezethetnek.
- A sejtek 10 Hz-es megszakítása nem teljes, de hasonlítható a morzsa és a pestel által okozott megszakításhoz (3.B ábra). Míg a legtöbb sejt megszakad, ha 30 Hz-es hőmérsékleten feldolgozzák, az ezekből a sejtekből készült kivonat inaktív. A 30 Hz-es hőmérsékleten feldolgozott sejtekből származó törmelékek hajlamosak egymáshoz ragaszkodni, és komplexek, például a spliceozóma pelletálódásához vezethetnek. Ezért a 10 Hz-nél magasabb feldolgozás más eljárásokhoz nem ajánlott.
- Összehasonlítva a malom és a malom által megszakított sejtekből készült kivonatokat a golyós Malomhoz képest, a BioRad Protein Assay BSA-szabványnak megfelelő vizsgálatával összehasonlítható szintű fehérjét, valamint a spliceozomális snRNA-k összehasonlítható szintjeit a primer-kiterjesztéssel végzett vizsgálat során (adat nem látható).
Bufferek és megoldások
Proteáz inhibitor koktél
- 100mM AEBSF
- 100 μg/ml leupeptin
- 100 μg/ml Aprotinin
- 100 mM benzamidin
Puffer AGK
- 10 mM HEPES pH 7,9
- 1,5 mM MgCl2
- 200 mM KCI
- 10% vol/vol glicerin
- 0,5 mM DTT (friss hozzáadás használat előtt)
Puffer D
- 20 mM HEPES pH 7,9
- 0,2 mM EDTA
- 50 mM KCI
- 20% vol/vol glicerin
- 0,5 mM DTT (friss hozzáadás használat előtt)