Sejtmegszakítás & Biológiai minták A SEJTBONTÁSTÓL A HOMOGENIZÁLÁSIG ÉS A LEGKÜLÖNFÉLÉBB BIOLÓGIAI ANYAGOK PORLASZTÁSÁIG
A biológiai minták, például csontok, növények, izmok vagy köpet előkészítése a DNS, RNS, fehérjék vagy metabolitok elemzéséhez kihívást jelenthet. A RETSCH olyan laboratóriumi malmokat és őrlőket kínál, amelyek porlasztják és homogenizálják a szilárd anyagokat, de alkalmasak sejtbontásra is. A RETSCH malmokat olyan területeken használják, mint a biotechnológia, a diagnosztika, a törvényszéki orvostan, a mezőgazdaság és a mikrobiológia.
Mikroorganizmusok sejtbontása (szuszpenzióban)
A biológiai minták, például csontok, növények, izmok vagy köpet előkészítése a DNS, RNS, fehérjék vagy metabolitok elemzéséhez kihívást jelenthet. A RETSCH olyan laboratóriumi malmokat és őrlőket kínál, amelyek porlasztják és homogenizálják a szilárd anyagokat, de alkalmasak sejtbontásra is. A RETSCH malmokat olyan területeken használják, mint a biotechnológia, a diagnosztika, a törvényszéki orvostan, a mezőgazdaság és a mikrobiológia.
MM 400 malom - élesztősejt feltárása*
*A videón a korábbi modell látható, azonos működési elvvel.
Az összfehérje-koncentráció megnövelt reprodukálhatósága sejtbontás után, 7 percig
MM 400-ban, 12 perc Vortex.
Hibasávok: % standard eltérés.
A MM 400 akár 20 mintát is feldolgoz 1,5 vagy 2 ml-es Eppendorf csövekben keresztkontamináció nélkül, ami időt takarít meg a kezelő számára. Ezenkívül egy adapter is rendelkezésre áll, amely akár nyolc 50 ml-es Falcon-cső befogadására is alkalmas. A sejtbontáshoz a sejtek típusától függően változik az optimális gyöngyméret; baktériumok és élesztők esetében a 0,75-1,5 mm közötti üveggyöngyök ajánlottak, míg gombák és mikroalgák esetében a 0,1-0,5 mm közötti kisebb gyöngyök alkalmasabbak.
DNS vagy RNS extrakcióhoz a kisebb, legfeljebb 2 ml-es egyszer használatos csövek ideálisak, míg a fehérjék vagy metabolitok feldolgozásához az 50 ml-es Falcon csövekhez hasonló nagyobb üvegek jól alkalmazhatók. Az optimális göngyölési paraméterek sejttípusonként változnak. A legjobb eredmény megtalálása némi kísérletezést igényelhet. Általában 30 s (a legtöbb mikroalga) és 7 perc (élesztők általában) közötti gyöngyözés szükséges a sejtek teljes felbontásához.
Azáltal, hogy akár ötven darab 2 ml-es egyszer használatos fiolát is fogad, a Mixer Mill MM 500 vario hatékonyan növeli a sejtek felbontásához szükséges mintaátmenő képességet.
A Phaeodactylum tricornutum sejtjei a sejtbontás előtt (balra) és után (jobbra) az MM 400 és a Falcon-cső adapterrel kombinált MM 400 segítségével.
Hőmérséklet-szabályozás a sejtek szuszpenziójában történő gyöngyözéshez
A hőmérséklet döntő szerepet játszik, különösen azokban az alkalmazásokban, ahol hőmérsékletérzékeny fehérjékről van szó, például a sejtek bontása esetén. Az egyik megoldás a kriogén őrlés (lásd a megfelelő szakaszt), a másik a sejtszuszpenzió hűtése. A MM 400 esetében kimutatták, hogy a hőnövekedés 2 ml-es csövekben még 30 Hz-en is mérsékelt; egy egyszerű megoldás a bontási idők >1 perc megszakítása az adapter és a fiolák egyperces jégfürdőben történő hűtésével. Így a hőmérséklet a használt gyöngymérettől függően 12-15 °C alatt marad.
A gyöngyözés során a hőmérséklet alakulásának szabályozására a Mixer Mill MM 500 vezérlés segítségével van mód. Egy speciális adapter tizennyolc 2 ml-es egyszer használatos fiola befogadására alkalmas tételenként. A gép egy 4 °C-os hűtött vizet tartalmazó hűtőhöz van csatlakoztatva, amely viszont az injekciós üvegeket tartó adaptert hűti. Így a szuszpenzió hőmérséklete 13°C körül tartható, de a jégfürdőben történő kényelmetlen kézi megszakítási fázisok nélkül. Bár az MM 500 vezérlő nem fogadja el az egyszer használatos falcon tube adaptert, 50, 80 vagy 125 ml térfogatú rozsdamentes acél őrlőedényekkel használható (lásd a bal oldali példát: P. pastoris).
Ha a malmot folyékony nitrogénnel és a CryoPaddel együtt használjuk, és 0 °C-ra állítjuk, a 2 ml-es egyszer használatos csövekben lévő sejtszuszpenzió hőmérséklete akár 0 °C-on is tartható a szuszpenzió lefagyasztása nélkül, így a hatékony gyöngyözés továbbra is lehetséges.
Mérőrendszer GrindControl A GrindControl valós időben mutatja, mi történik az őrlőedény belsejében
A GrindControl valós idejű betekintést nyújt az őrlőedényben zajló folyamatokba. A nyomás és a hőmérséklet folyamatos figyelemmel kísérése biztosítja a biztonságos és pontos szabályozást, még érzékeny vagy reaktív anyagok esetében is. Az eszköz segítségével azonnal reagálhat a váratlan nyomáscsúcsokra, és minden pillanatban szorosan figyelemmel kísérheti a hőmérsékletre érzékeny mintákat, sőt a mechanokémiai reakciókat is.
A GrindControl áttekintése
- Valós idejű nyomás- és hőmérsékleti adatok
- A kritikus állapotok korai felismerése
- Pontos folyamatirányítás
- Az érzékeny anyagok védelme
- Megismételhető eredmények
Lágy és kemény biológiai minták homogenizálása
Egyes biológiai anyagok, például a cisztás fibrózisos betegek köpetének vagy szövetminták, például máj, tüdő vagy daganatok, néha nehezebben homogenizálhatók teljesen. A 2 ml-es egyszer használatos csövek gyakran túl kicsik ahhoz, hogy a teljes mintatérfogat beleférjen, így a mintát a homogenizálási folyamat után fel kell osztani és újra össze kell állítani, ami plusz munkát és időt jelent a laboratóriumi rutinban.
A nagyobb, rozsdamentes acélból készült őrlőedények például képesek a teljes mintatérfogatot befogadni, de ezeket minden használat után tisztítani kell. Egy adapter a Mixer Mill MM 400 készülékhez megoldja ezt a problémát, mivel lehetővé teszi az 5 x 5 ml-es egyszer használatos csövek használatát, amelyek nagyobb kapacitással rendelkeznek és nem szükséges a tisztításuk. Tételenként egyszerre 10 minta homogenizálható. 50 ml-es sólyomcsövek is használhatók szöveti anyagok homogenizálására. Itt tételenként 8 minta dolgozható fel mindössze néhány perc alatt.
Májminta a homogenizálás előtt és után az MM 400-ban
Biológiai minták kriogén őrlése
Egyes biológiai minták, például rostos növények, kemény vénák, körmök vagy bizonyos állati vagy tumorszövetek nehezen homogenizálhatók pufferrendszerben. Vagy túl puhák, vagy túl kemények, vagy túl rostosak ahhoz, hogy szuszpenzióban hatékonyan porlaszthatók legyenek. Ezen anyagok esetében jobb alternatíva a kriogén őrlés, amely során az őrlési folyamat előtt vagy közben folyékony nitrogénnel fagyasztják le őket. Ez a technika a mintákat rideggé teszi, és könnyen homogén porrá zúzhatóvá. A kriogén őrlés előnye az is, hogy megőrzi például a fehérjék vagy az illékony vegyületek integritását, amelyek magasabb hőmérsékleten lebomolhatnak vagy elpárologhatnak. A kriogén őrlés továbbá képes megtörni egyes organizmusok, például az élesztő intracelluláris organellumait.
A ragadós anyagok, például a bogyók esetében a kriogén őrlés gyakran az egyetlen megvalósítható módszer az egyenletes minta előállítására. A táblázat néhány példát sorol fel, amelyeket sikeresen dolgoztak fel kriogén őrléssel a Mixer Mill MM 400 vagy a CryoMill berendezésben. Az MM 400-ban 2 ml-es acélcsövek használhatók kriogén őrléshez. Hasonló hatás érhető el a MM 500 control berendezésben is, nagyobb térfogatú, akár 125 ml-es őrlőedényekkel. Itt a CryoPad mus folyékony nitrogénnel dolgozni. Minden említett malomban 2 ml-es rozsdamentes acélcsövek és a megfelelő adapterek is rendelkezésre állnak a kisebb térfogatokhoz.
| Minta | Kiegésztők | Feed quantity | Őrlési idő | Sebesség | Max. végfinomság (d90)/ Results |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli baktériumok |
|
2 x 10 ml fagyasztott sejtpellet | 2 min | 30 Hz | teljes sejtbontás |
| izomszövet |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | 150 µm |
| fenyőtű |
|
2 tű per vial | 3 min | 30 Hz | Reprodukálható RNS extrakció 20 mintából egy lépésben |
| bogyók |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| körmök |
|
1 ujjköröm injekciós üvegenként | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| patkánybél |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
kriogén őrlés előtt és után
kriogén őrlés előtt és után
Megbízható RNS detektálás a szúnyogfelügyeletben – Hatékony, reprodukálható, hőmérséklet-ellenőrzött
A felügyeleti laboratóriumok kettős kihívással szembesülnek: A mechanikai homogenizáció olyan súrlódási hőt termel, amely visszafordíthatatlanul károsítja az RNS-t és hamis-negatív PCR eredményeket eredményez. Az MM 500 control segítségével akár 36 moszkvai pool egyidejűleg homogenizálható, állandó hőmérsékleten 15 °C alatt – egyetlen manuális megszakítás nélkül. Az alumínium adapter a hűtőfolyadékot közvetlenül 18 Eppendorf csövre juttatja minden aprítóállomáson; az egyszer használatos reakciós edények megbízhatóan megakadályozhatják a keresztfertőzést.
A gyakorlatra vonatkozó ajánlások
Az RNS lebomlása a szobahőmérsékleten percek alatt kezdődik. A 25–28 Hz-es és 45–60 másodperces csiszolási idő alatt készült (2–3 mm) rozsdamentes acél golyók hatékonynak bizonyultak, és közvetlenül SOP-ként tárolhatók a műszerben. A GLP követelményeknek megfelelően működő laboratóriumok részesülnek az opcionális GrindControl rendszerből a hőmérséklet és a nyomás zökkenőmentes, valós idejű dokumentációjához.
Törvényszéki minták
A törvényszéki minták, például a haj, a csontok és a fogak többnyire törékenyek, ezért általában nincs szükség hűtésre a porítás előtt. A kívánt analitikai finomság eléréséhez előfordulhat, hogy az anyagot előzetesen egy Jaw Crusher vagy , hogy a szemcseméretüket 10 mm alá csökkentsék a Golyósmalom-ban történő további feldolgozáshoz. A Vágómalmok olyan csontok előzúzására szolgálnak, amelyek frissek, tehát nem teljesen szárazak, és akár húsmaradványokat is tartalmazhatnak.
A RETSCH a lágy, középkemény, rugalmas, szívós és szálas mintaanyagok elsődleges méretcsökkentésére szolgáló vágómalmokat kínál. A tartozékok széles választéka lehetővé teszi a különböző alkalmazásokhoz való optimális alkalmazkodást. A SM 300 három különböző rotorral és 0,25 mm-től 20 mm-ig terjedő alsó szitákkal szerelhető fel. A friss és zsíros csontokkal ellentétben a száraz csontok egy vagy két lépésben 0,25 mm alatti méretre csökkenthetők. Az SM 300 változó fordulatszámmal rendelkezik 100 és 3000 fordulat/perc között. A csontok, fogak vagy szőrzet porlasztása többnyire golyósmalmokban történik, acélból, cirkónium-oxidból vagy volfrámkarbidból készült > 5 mm-es őrlőgolyókkal.
Mosási eljárás intakt baktériumsejtek kinyerésére emberi szövetből
Az ízületpótló műtétek, például a könyök vagy a térd műtétjének egyik lehetséges szövődménye a környező szövetek különböző baktériumok általi fertőzése. Ezek a fertőzések, amelyeket protézisízületi fertőzéseknek (PJI) neveznek, a műtét után néhány naptól akár több évig is előfordulhatnak. Nehezen kezelhetők, mivel különböző típusú baktériumok okozhatják őket, és a hagyományos módszerekkel nem mindig mutathatók ki. Ezért szükséges a baktériumokat a szövetmintákból úgy izolálni, hogy megőrizzék életképességüket, és lehetővé tegyék azonosításukat és tenyésztésüket.
Ez az a pont, ahol a Mixer Mill MM 400 egy egyszerű eljárással segíthet: A mintákat 20 ml steril demineralizált vízzel és 5 ml 1 mm-es üveggyönggyel keverjük össze egy sterilizált acéledényben. Egyszer használatos 30 ml-es széles szájú üvegek használhatók. Legfeljebb 8 palackot rázunk 3,5 percig 30 Hz-en, hogy a baktériumokat eltávolítsuk a mintákból anélkül, hogy elpusztítanánk őket. A baktériumok ezután könnyen tenyészthetők agarlemezen a további elemzéshez. Ez a módszer magas kimutatási aránnyal rendelkezik (A.-L. Roux et. al 2010), és bármilyen szilárd fertőzött szövetre alkalmazható, még akkor is, ha az beültetett anyagot tartalmaz.
Alkalmas malmok sejtbontáshoz és minta homogenizálásához
További betekintést nyerhet fehér könyveink és cikkeink segítségével
Cell disruption of parasites with Bead Beating
Giardia and Cryptosporidia are parasites which occur in water and can cause diarrhoea in humans. They are persistent forms found in water and are resistant to environmental influences and disinfectants. Detection and quantitative determination of the parasites are typically performed in accordance with ISO 15553 „Water Quality – Isolation and Enumeration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water“. A German microbiological laboratory has now tested a mechanical approach by using RETSCH’s Mixer Mill MM 400 for bead beating.
Cryogenic Disruption of Yeast Cells
At the Ernst Ruska-Centre-3 (ER-C-3) for Microscopy and Spectroscopy with Electrons, one of the institutes of the renowned Forschungszentrum Jülich, researchers harness the power of cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography to answer important questions regarding the structure and function of biological membranes and membrane-associated protein complexes. To this end, various cellular systems, including yeast, are used as models to study the membrane systems of interest.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
The Michael Rout Lab at the Rockefeller University in New York, NY, initially contacted RETSCH Inc. in 2006 to discuss the possibility of using the Planetary Ball Mill to cryogenically grind yeast cell pellets. The aim of their experiment was to explore the construct of Nuclear Pore Complexes located on the cell walls of yeast cells. The decision to use a Planetary Ball Mill for this application was mainly based on the fact that it produces very small particle sizes which were considered an important prerequisite for more in-depth analysis of the yeast cells.
Prosthetic joint infections: New method allows for diagnostics of up to 8 samples with high documentation rate
One of the major risks of a joint replacement is prosthetic joint infection (PIJ), a bacterial infection at the interface of implant, tissue, and bone. In 2010, A.-L. Roux et al. published an article titled „Diagnosis of prosthetic joint infection by beadmill processing of a periprosthetic specimen.“ It describes a new diagnosis method of involved microbes, with an impressive documentation rate of more than 83% and, at the same time, a very low contamination rate of 8.7%. The method involves washing the microbes off the tissue samples in a RETSCH Mixer Mill within 210 seconds.
Temperature-controlled preparation of biochemical samples
The temperature plays an important role in biochemical analyses. To ensure that the properties of biological samples are not altered during sample preparation, it is necessary to continuously cool or sometimes even freeze the sample material. This application article describes how the Mixer Mill MM 500 control with its possibilities of temperature-controlled sample processing is used for preparing biochemical samples. As an application example, we present the cell disruption process of a global pharmaceutical and diagnostics company.
What Hair Reveals
The detection of illegal drugs and pharmaceuticals plays a role in various fields, for example in forensic science, road traffic accidents, in competitive sports or at the workplace. Hair has the great advantage of storing the substances for a long period, which means that detection is still possible several months after consumption of the drug. In addition to the detection of drugs, hair samples are also used for DNA analysis as well as for the analysis of heavy metals and minerals.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
The Michael Rout Lab at the Rockefeller University in New York, NY, initially contacted RETSCH Inc. in 2006 to discuss the possibility of using the Planetary Ball Mill to cryogenically grind yeast cell pellets. The aim of their experiment was to explore the construct of Nuclear Pore Complexes located on the cell walls of yeast cells. The decision to use a Planetary Ball Mill for this application was mainly based on the fact that it produces very small particle sizes which were considered an important prerequisite for more in-depth analysis of the yeast cells.
Homogenization of tough biological secretions or tissue pieces
Sometimes the preparation and homogenization of biological samples can be as tough as the material itself. The widely used 2 ml single-use Eppendorf tubes are often not large enough to accommodate the whole sample volume; hence, the sample needs to be divided and reunited after the homogenization process which means an additional time-consuming working step in the lab routine. While it is true that usually larger sized grinding jars, e. g. of stainless steel, are available which accommodate the complete sample volume, these have the drawback of requiring cleaning after use.
White Paper: Important Aspects of Sample Preparation of Biological Materials
Biological samples exist in all shapes and sizes: hard bones, tough and fibrous plants, tough and viscous sputum, soft muscles, tumor or liver tissue. Not to mention the millions of cells such as yeast, bacteria or algae, which have to be disrupted for applications such as DNA or RNA isolation or protein extraction. Retsch offers a range of mills and grinders for easy and reproducible pulverization of solid sample materials some of which are also suitable for cell disruption and homogenization of biological sample materials.
Forduljon hozzánk ingyenes konzultációért!
A RETSCH termékek és szolgáltatások leányvállalatok és teljes körűen képzett forgalmazók globális hálózatán keresztül érhetők el. Munkatársaink szívesen segítenek Önnek bármilyen kérdésben.
Cell Disruption & Biológiai minták - FAQ
Mi az a gyöngyverés a sejtbontáshoz?
A gyöngyözés, a sejtbontásra széles körben alkalmazott mechanikai módszer, alapvető fontosságú a sejtkomponensek kivonásához olyan mikroorganizmusokból, mint a baktériumok, élesztőgombák, gombák vagy mikroalgák. Ez a folyamat gyöngyökkel nyírja a szuszpenzióban lévő sejteket, és különböző méretű üvegek és csövek segítségével különböző léptékben végezhető. Az adapterekkel ellátott RETSCH keverőmalmok által biztosított automatizálás egyszerűsíti a gyöngyözés folyamatát, biztosítva annak gyors, hatékony és reprodukálható voltát.
A gyöngyök optimális mérete és paraméterei sejttípusfüggőek, így a legjobb eredmények eléréséhez kísérletezésre van szükség. Az MM 400 például akár 20 mintát is képes feldolgozni 1,5 vagy 2 ml-es Eppendorf-csövekben keresztkontamináció nélkül. A rendelkezésre álló adapter akár nyolc 50 ml-es Falcon-cső befogadását is lehetővé teszi, ami tovább növeli a folyamat sokoldalúságát.
Mikor érdemes kriogén őrlést alkalmazni?
A kriogén őrlés nélkülözhetetlenné válik, ha olyan kihívást jelentő mintákat kezelünk, amelyek ellenállnak a homogenizálásnak a hagyományos pufferrendszerekben. Ez különösen igaz a rostos növényekre, a kemény vénákra, a körmökre vagy a különleges állati vagy tumorszövetekre. A technika folyékony nitrogén alkalmazásával fagyasztja le a mintákat az őrlési folyamat előtt vagy közben. Ez a kriogén fagyasztás törékennyé teszi a mintákat, megkönnyítve azok homogén porrá zúzását.
A kriogén őrlés folyamata határozott előnyökkel jár, megőrizve a fehérjék vagy az illékony vegyületek integritását, amelyek magasabb hőmérsékleten lebomlanának vagy elpárologhatnának. Emellett bizonyos organizmusoknál hatékonynak bizonyul az intracelluláris organellumok lebontásában. Különösen a kriogén őrlés az egyetlen megvalósítható módszer a ragadós anyagok, például a bogyók egységes mintáinak előállítására.
Az optimális eredmények érdekében a kriogén őrlés olyan speciális berendezésekkel végezhető, mint a CryoMill vagy a 2 ml-es acélcsövek befogadására alkalmas MM 400 kegolyósmalom. A kifejezetten folyékony nitrogénnel (LN2) való munkához tervezett MM 500 vezérlésű Mixer Mill MM 500 kifejezetten nagyobb, akár 125 ml-es őrlőedényeket fogad be.
Az ideális malmok kiválasztása a törvényszéki minták, például csontok és hajszálak porításához
Az olyan törvényszéki minták, mint a csontok vagy fogak porítására az állkapocsdarálók vagy a vágómalmok az optimális választás a méretcsökkentési folyamat első lépéséhez. A RETSCH a különböző mintaanyagok, köztük puha, közepesen kemény, rugalmas, kemény és szálas anyagok elsődleges méretcsökkentésére tervezett vágómalmok változatos választékát kínálja. A tartozékok széles választéka biztosítja, hogy ezek a malmok zökkenőmentesen a különböző alkalmazásokhoz igazíthatók.
A sokoldalú SM 300 például három különböző rotorral és 0,25 mm-től 20 mm-ig terjedő alsó szitával, valamint 100 és 3000 fordulat/perc között változtatható fordulatszámmal rendelkezik. Ez a rugalmasság teszi kiváló eszközzé a speciális törvényszéki mintafeldolgozási igényekhez való alkalmazkodáshoz.
A további feldolgozási lépésekhez fontolja meg az 5 mm-nél nagyobb őrlőgolyókkal felszerelt golyósmalmok használatát, amelyek olyan anyagokból készültek, mint az acél, a cirkónium-oxid vagy a volfrámkarbid. A hajszálak porlasztásához az olyan keverőmalmok, mint az MM 400 a legjobb választás.