Dne 24. srpna 2005 byla publikována následující technická zpráva Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill.
Příprava buněk
Skliďte 2 litry buněk vypěstovaných do střední až pozdní fáze kmene rotací při 6000 g po dobu 15 minut. Dvakrát promyjte buňky chlazeným pufrem AGK. Odhadněte objem buněčné pelety a přidejte 0,4 objemu chlazeného AGK. Vortex vytvoří hustou buněčnou suspenzi. Přidejte koktejl inhibitoru proteázy na konečnou koncentraci 1x. Přidejte suspenzi po kapkách do 50 ml kónického roztoku, který je naplněn kapalným dusíkem, pomocí pipety nebo injekční stříkačky opatřené jehlou. Mezi kapkami nechte několik sekund, aby správně zmrzly. Kapalný dusík doplňte podle potřeby a nezapomeňte několikrát propíchnout uzávěr jehlou, jinak vybuchne! Zmražené pelety pak můžete skladovat při teplotě -80 °C, dokud nebudete chtít pokračovat.
Mletí extraktu
Před spuštěním mlýna naplňte kanystry vodou (žádná kulička! Když kanystry pustíte s kuličkou, ale bez pevného vzorku, kanystr zničíte) a mlýn krátce spusťte na frekvenci 30 Hz, abyste se ujistili, že teflonový O kroužek v kanystru stále vytváří účinné těsnění. Nerezové mlecí nádoby a mlecí kuličky předem vychlaďte v kapalném dusíku. Použijte buď mlecí kouli o průměru 25 mm, nebo 30 mm podle množství buněčných pelet, pokud je nádoba příliš plná, vzorek nebude účinně rozemlet. Při sklizni 2 l se obvykle získá mlecí peletka o objemu přibližně 5 ml plus 2 ml AGK pufru. 7 ml zmrazené mlecí buněčné suspenze se pohodlně vejde do 30 mm koule v 50 ml mlecím kanystru (buňky zaplní většinu spodní poloviny nádoby, obr. 1). Pokud se frézuje pouze jeden vzorek, použijte jako rovnováhu druhý prázdný kanystr (bez kuličky).
Zpracování práškových buněk pro extrakt z celých buněk
Rozmrazte prášek rychle a úplně (s ručním mícháním) v lázni 25°-30° a poté umístěte na led. Roztočte 17K 30 minut v rotoru SS34 při 4°. Vyhněte se peletám a Vrstvě lipoproteinu v horní části zkumavky, přeneste supernatant do ultracentrifugační zkumavky. Roztočte při 100 000 g po dobu 1 hodiny. Opět, vyhněte se lipoproteinové Vrstvě a peletě, odstraňte střední Vrstvu. Dvakrát dialyzujte v zkumavce s molekulovou hmotností 10 000 po dobu 1,5 hodiny při 4°C proti 2 l pufru D (postup přezkoumán Stevensem a Abelsonem, 2002). Extrakt roztočte při maximální rychlosti v mikrofuze při 4° po dobu 5 minut, aby se odstranily usazeniny a sraženiny. Alikvotní a zmrazené supernatanty v kapalném dusíku. Uchovávejte při -80°C.
Obrázek 3. Extrakty z buněk narušených kulovým mlýnem Retsch MM301 jsou srovnatelné s těmi, které byly vytvořeny buňkami narušenými maltou a paličkou. Stejný kmen kvasinek byl zpracováván paralelně s jediným rozdílem v metodě narušení buněk. Buňky byly narušeny buď ručně maltou a paličkou, nebo pěti 3minutovými cykly v kulovém mlýně Retsch MM301 nastavenými na 10, 20 nebo 30 Hz. A. Aktivita kvasinkového extraktu byla měřena účinností sestřihu in vitro přepsaného aktinu pre mRNA substrátu (přezkoumáno Stevensem a Abelsonem, 2002). B. Zředění buněk 1:10 bylo sledováno pod cílem 100X ihned po narušení. Všechny tyto vzorky buněk začaly zhruba ve stejné koncentraci. Zjevný rozdíl v buněčném množství ve vzorcích 20 a 30 Hz ve srovnání se vzorkem 10 Hz je způsoben agregací buněčných zbytků.
Poznámky a kritické parametry
- Aktivita sestřihu extraktů vyrobených paralelně z buněk narušených maltou a paličkou oproti kulovému mlýnu (při 10 Hz) má srovnatelnou sestřihovou aktivitu (obr. 3A), což naznačuje, že RNA, stejně jako bílkovina, zůstávají po zpracování kulovým mlýnem neporušené a aktivní. Zvýšení cyklů narušení z 5 cyklů na 8 nebo 10 cyklů nezvýšilo účinnost sestřihu (údaje nejsou zobrazeny). Narušení buněk kulovým mlýnem je rychlejší, méně náročné na práci a reprodukovatelnější než narušení buněk maltou a paličkou.
- Extrakty vyrobené z buněk narušených při vyšší než 10 Hz vykazují sníženou sestřihovou aktivitu (obr. 3A). Jiné laboratoře zabývající se kvasinkami však uvedly, že pro imunoprecipitaci používají kulový mlýnek při 30 Hz (viz protokol Marcuse Kalkuma, který je k dispozici u Retsche). Pro nové aplikace je vhodné vyzkoušet rozsah mletí a rychlostí.
- Všimněte si, že extrakt na obr. 3A vyrobený z buněk mletých při 20 Hz vykazuje těsnější mRNA pásmo, což může být způsobeno sníženou aktivitou poly A ve srovnání s ostatními extrakty. Tento trend se ve srovnatelné studii s jiným kmenem nereprodukční. Pozorované rozdíly v hladinách mRNA na obr. 3 naznačují, že různé metody narušení buněk mohou vytvářet extrakty s mírně odlišnými biochemickými vlastnostmi.
- Narušení buněk při frekvenci 10 Hz není úplné, ale vypadá srovnatelně s narušením maltou a paličkou (obr. 3B). Zatímco většina buněk je narušena při mletí při frekvenci 30 Hz, extrakt z těchto buněk je neaktivní. Zbytky z buněk mletých při frekvenci 30 Hz mají tendenci držet pohromadě a mohou mít za následek peletování komplexů, jako je sestřihozom. Proto nemusí být frézování vyšší než 10 Hz vhodné pro jiné postupy.
- Při porovnání extraktů z buněk narušených maltou a paličkou s kulovým mlýnem jsme zjistili srovnatelné hladiny proteinů, jak je stanovuje BioRad Protein Assay se standardem BSA, a srovnatelné hladiny spliceosomálních snRNA, jak je stanovuje primer extension (data nejsou zobrazena).
Pufry a řešení
Koktejl inhibitoru proteázy
- 100mM AEBSF
- 100 ug/ml leupeptinu
- 100 ug/ml Aprotinin
- 100 mM Benzamidin
Buffer AGK
- 10 mM HEPES pH 7,9
- 1,5 mM MgCl2
- 200 mM KCI
- 10% obj./obj. glycerolu
- 0,5 mM DTT (přidáno čerstvé před použitím)
Buffer D
- 20 mM HEPES pH 7,9
- 0,2 mM EDTA
- 50 mM KCI
- 20% objemový/objemový glycerol
- 0,5 mM DTT (přidáno čerstvé před použitím)