Making Whole Cell Extract of Saccharomyce

Recoger 2 litros de células cultivadas hasta la fase logarítmica media o tardía girando a 6.000g durante 15 minutos. Lavar las células dos veces con tampón enfriado AGK. Estimar el volumen del sedimento celular y añadir 0,4 volúmenes de AGK enfriado. Revolver para hacer una suspensión celular espesa. Añadir cóctel inhibidor de proteasas hasta una concentración final de 1x. Añadir la suspensión gota a gota en una cónica de 50 ml que se llena de nitrógeno líquido, utilizando una pipeta o una jeringa equipada con una aguja. Dejar unos segundos entre gotas para que se congelen correctamente. Rellenar el nitrógeno líquido según sea necesario y recuerde pinchar el tapón varias veces con una aguja o explotará! Los pellets congelados se pueden almacenar a continuación a -80 °C hasta que se desee continuar.

1. La actividad de corte y empalme de extractos hechos en paralelo de células rotas por mortero y mano versus el Molino de Bolas (a 10 Hz) tiene una actividad de corte y empalme comparable (Fig. 3A), lo que indica que el ARN, así como la proteína, permanecen intactos y activos después del procesamiento con el Molino de Bolas. El aumento de los ciclos de ruptura de 5 ciclos a 8 o 10 ciclos no aumentó la eficiencia del corte y empalme (datos no mostrados). La ruptura celular por el Molino de Bolas es más rápida, requiere menos mano de obra y es más reproducible que la ruptura celular por mortero y mano de obra.
2. Los extractos hechos de células rotas a más de 10 Hz muestran una actividad de empalme reducida (Fig. 3A). Sin embargo, otros laboratorios de levaduras han reportado el uso del Molino de Bolas a 30 Hz para inmunoprecipitación (ver protocolo de Marcus Kalkum, disponible de Retsch). Es recomendable probar un rango de tiempos y velocidades de molienda para nuevas aplicaciones.
3. Obsérvese que el extracto de la Fig. 3A hecho de células molidas a 20 Hz muestra una banda de ARNm más estrecha, lo que puede deberse a una actividad reducida de poli A en comparación con los otros extractos. Esta tendencia no se reprodujo en un ensayo comparable con una cepa diferente. Las diferencias observadas en los niveles de ARNm en la Fig. 3 sugieren que los variados métodos de ruptura celular pueden generar extractos con propiedades bioquímicas ligeramente diferentes.
4. La ruptura de las células a 10 Hz es incompleta, pero parece comparable a la ruptura por mortero y mano de mortero (Fig. 3B). Si bien la mayoría de las células se rompen cuando se muelen a 30 Hz, el extracto hecho de estas células está inactivo. Los desechos de las células molidas a 30 Hz tienden a pegarse entre sí y pueden dar lugar a la peletización de complejos, como el spliceosoma. Por lo tanto, la molienda superior a 10 Hz puede no ser aconsejable para otros procedimientos.
5. Al comparar extractos hechos de células rotas por mortero y mano versus el Molino de Bolas, vimos niveles comparables de proteína, como se ensayó por BioRad Protein Assay con un estándar de BSA, y niveles comparables de ARNsn espliceosómicos, como se ensayó por extensión del cebador (datos no mostrados).Encontramos que los extractos se comportaron de manera comparable cuando se agotaron y reconstituyeron para una proteína espliceosómica y un ARNsn espliceosómico (datos no mostrados).