Making Whole Cell Extract of Saccharomyce

Récoltez 2 litres de cellules cultivées jusqu'à la phase logarithmique moyenne à tardive en filant à 6 000 g pendant 15 minutes. Lavez les cellules deux fois avec du tampon réfrigéré AGK. Estimez le volume de pastille cellulaire et ajoutez 0,4 volume d'AGK réfrigéré. Vortex pour obtenir une suspension cellulaire épaisse. Ajoutez le cocktail inhibiteur de protéase à une concentration finale de 1x. Ajouter la suspension goutte à goutte dans un conique de 50 ml rempli d'azote liquide, à l'aide d'une pipette ou d'une seringue munie d'une aiguille. Laisser quelques secondes entre les gouttes pour qu'elles gèlent correctement. Remplir l'azote liquide au besoin et n'oubliez pas de perforer le bouchon plusieurs fois avec une aiguille sinon il explosera ! Les pastilles congelées peuvent alors être conservées à -80°C jusqu'à ce que vous souhaitiez continuer.

1. L'activité d'épissage des extraits fabriqués en parallèle à partir de cellules perturbées par le mortier et le pilon par rapport au Broyeur à boulets (à 10 Hz) a une activité d'épissage comparable (figure 3A), ce qui indique que l'ARN, ainsi que les protéines, demeurent intacts et actifs après transformation au Broyeur à boulets. L'augmentation des cycles de perturbation de 5 cycles à 8 ou 10 cycles n'a pas augmenté l'efficacité de l'épissage (données non présentées). La perturbation cellulaire par le Broyeur à boulets est plus rapide, moins exigeante en main-d'oeuvre et plus reproductible que la perturbation cellulaire par le mortier et le pilon.
2. Les extraits obtenus à partir de cellules perturbées à plus de 10 Hz montrent une activité d'épissage réduite (figure 3A). Cependant, d'autres laboratoires de levure ont signalé utiliser le Broyeur à billes à 30 Hz pour l'immunoprécipitation (voir le protocole de Marcus Kalkum, disponible chez Retsch). Il est conseillé d'essayer une gamme de temps et de vitesses de broyage pour de nouvelles applications.
3. Notez que l'extrait de la figure 3A réalisé à partir de cellules broyées à 20 Hz montre une bande d'ARNm plus étroite, ce qui pourrait être dû à une activité poly A réduite par rapport aux autres extraits. Cette tendance ne s'est pas reproduite dans un essai comparable avec une souche différente. Les différences observées dans les niveaux d'ARNm de la figure 3 suggèrent que les différentes méthodes de perturbation cellulaire peuvent générer des extraits aux propriétés biochimiques légèrement différentes.
4. La perturbation des cellules à 10 Hz est incomplète, mais elle semble comparable à celle causée par le mortier et le pilon (figure 3B). Alors que la plupart des cellules sont perturbées lorsqu'elles sont broyées à 30 Hz, l'extrait obtenu à partir de ces cellules est inactif. Les débris des cellules broyées à 30 Hz ont tendance à coller ensemble et peuvent entraîner le bouletage de complexes, comme le splicéosome. Par conséquent, un broyage supérieur à 10 Hz peut ne pas être recommandé pour d'autres procédures.
5. En comparant les extraits obtenus à partir de cellules perturbées par le mortier et le pilon par rapport au Broyeur à boulets, nous avons observé des niveaux comparables de protéines, tels que mesurés par BioRad Protein Assay avec une norme BSA, et des niveaux comparables de snRNA splicéosomiques, tels que mesurés par extension d'amorce (données non montrées).