Making Whole Cell Extract of Saccharomyce

Raccolgere 2 litri di cellule cresciute in fase log intermedia o tardiva centrifugando a 6.000g per 15 minuti. Lavare le cellule due volte con tampone AGK refrigerato. Stimare il volume del pellet cellulare e aggiungere 0,4 volumi di AGK refrigerato. Vortex per ottenere una sospensione cellulare densa. Aggiungere il cocktail di inibitori di proteasi a una concentrazione finale di 1x. Aggiungi la sospensione goccia a goccia in un becher da 50 ml riempito di azoto liquido, utilizzando una pipetta o una siringa dotata di ago. Lascia qualche secondo tra una goccia e l'altra in modo che congelino correttamente. Rifornisci l'azoto liquido se necessario e ricorda di forare il tappo più volte con un ago, altrimenti esploderà! I pellet congelati possono quindi essere conservati a -80°C fino a quando non vorrai continuare.

1. L'attività di splicing degli estratti preparati in parallelo da cellule disgregate con mortaio e pestello rispetto al mulino a sfera (a 10 Hz) ha un'attività di splicing paragonabile (Fig. 3A), indicando che RNA, così come proteine, rimane intatto e attivo dopo il trattamento con il mulino a sfera. L'aumento dei cicli di disgregazione da 5 a 8 o 10 cicli non ha aumentato l'efficienza di splicing (dati non mostrati). La disgregazione cellulare con il mulino a sfera è più veloce, meno laboriosa e più riproducibile rispetto alla disgregazione cellulare con mortaio e pestello.
2. Gli estratti ottenuti da cellule disgregate a frequenze superiori a 10 Hz mostrano una ridotta attività di splicing (Fig. 3A). Tuttavia, altri laboratori di lieviti hanno riportato l'uso del mulino a 30 Hz per l'immunoprecipitazione (vedere il protocollo di Marcus Kalkum, disponibile da Retsch). È consigliabile provare una gamma di tempi e velocità di macinazione per nuove applicazioni.
3. Si noti che l'estratto in Fig. 3A ottenuto da cellule macinate a 20 Hz mostra una banda di mRNA più stretta, il che potrebbe essere dovuto a una ridotta attività poli A rispetto agli altri estratti. Questa tendenza non si è riprodotta in un esperimento comparabile con una diversa ceppo. Le differenze osservate nei livelli di mRNA in Fig. 3 suggeriscono che i metodi vari di disgregazione cellulare possono generare estratti con proprietà biochimiche leggermente diverse.
4. La disgregazione delle cellule a 10 Hz è incompleta, ma appare paragonabile alla disgregazione con mortaio e pestello (Fig. 3B). Sebbene la maggior parte delle cellule venga disgregata macinando a 30 Hz, l'estratto ottenuto da queste cellule è inattivo. I detriti delle cellule macinate a 30 Hz tendono ad attaccarsi e possono causare la sedimentazione di complessi, come il spliceosoma. Pertanto, macinare oltre i 10 Hz potrebbe non essere consigliabile per altre procedure.
5. Confrontando gli estratti ottenuti da cellule disgregate con mortaio e pestello rispetto al mulino a sfere, abbiamo riscontrato livelli di proteine comparabili, come analizzato con BioRad Protein Assay con uno standard di BSA, e livelli di snRNA spliceosomiali comparabili, come analizzato con l'estensione del primer (dati non mostrati). Abbiamo riscontrato che gli estratti si sono comportati in modo comparabile quando sono stati impoveriti e ricostituiti per una proteina spliceosomiale e un snRNA spliceosomiale (dati non mostrati).