Making Whole Cell Extract of Saccharomyce

Ernten Sie 2 Liter Zellen, die bis zur mittleren bis späten Logphase gewachsen sind, indem Sie 15 Minuten bei 6000 g drehen. Waschen Sie Zellen zweimal mit gekühltem Puffer AGK. Schätzen Sie das Volumen des Zellpellets und geben Sie 0,4 Volumen gekühlte AGK hinzu. Wirbeln Sie, um eine dicke Zellsuspension herzustellen. Fügen Sie Proteaseinhibitorcocktail auf eine Endkonzentration von 1x hinzu. Geben Sie die Suspension tropfenweise in einen 50 ml-Kegel, der mit flüssigem Stickstoff gefüllt ist, mit einer Pipette oder einer Spritze, die mit einer Nadel versehen ist. Lassen Sie einige Sekunden zwischen den Tropfen, damit sie richtig einfrieren. Füllen Sie den flüssigen Stickstoff nach Bedarf wieder auf und denken Sie daran, die Kappe mehrmals mit einer Nadel zu durchstechen, sonst explodiert sie! Die gefrorenen Pellets können dann bei -80°C gelagert werden, bis Sie fortfahren möchten.

1. Die Spleißaktivität von Extrakten, die parallel aus Zellen hergestellt werden, die durch Mörtel und Stößel aufgeschlossen wurden, im Vergleich zur Mühle mit Kugel (bei 10 Hz), weist eine vergleichbare Spleißaktivität auf (Abb. 3A), was darauf hindeutet, dass die RNA sowie das Protein nach der Verarbeitung mit der Mühle mit Kugel intakt und aktiv bleiben. Eine Erhöhung der Aufschlusszyklen von 5 Zyklen auf 8 oder 10 Zyklen erhöhte die Effizienz des Spleißens nicht (Daten nicht gezeigt). Der Zellaufschluss durch die Mühle mit Kugel ist schneller, weniger arbeitsintensiv und reproduzierbarer als der Zellaufschluss durch Mörtel und Stößel.
2. Extrakte aus Zellen, die bei höheren als 10 Hz aufgeschlossen wurden, zeigen eine reduzierte Spleißaktivität (Abb. 3A). Andere Hefelabore haben jedoch berichtet, die Mühle bei 30 Hz zur Immunpräzipitation zu verwenden (siehe Protokoll von Marcus Kalkum, erhältlich bei Retsch). Es empfiehlt sich, für neue Anwendungen verschiedene Mahlzeiten und Geschwindigkeiten auszuprobieren.
3. Der Extrakt aus 20 Hz gemahlenen Zellen in Abb. 3A zeigt eine engere mRNA-Bande, was auf eine reduzierte Poly-A-Aktivität im Vergleich zu den anderen Extrakten zurückzuführen sein könnte. Dieser Trend reproduzierte sich in einer vergleichbaren Studie mit einem anderen Stamm nicht. Die beobachteten Unterschiede in den mRNA-Spiegeln in Abb. 3 legen nahe, dass die verschiedenen Methoden des Zellaufschlusses Extrakte mit leicht unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften erzeugen können.
4. Der Zellaufschluss bei 10 Hz ist unvollständig, sieht aber vergleichbar aus mit dem Aufschluss durch Mörtel und Stößel (Abb. 3B). Während die meisten Zellen beim Mahlen bei 30 Hz aufgeschlossen werden, ist Extrakt aus diesen Zellen inaktiv. Die Trümmer von Zellen, die bei 30 Hz gemahlen werden, neigen dazu, zusammenzukleben und können zur Pelletierung von Komplexen, wie dem Spleißosom, führen. Daher ist das Mahlen von mehr als 10 Hz für andere Verfahren möglicherweise nicht ratsam.
5. Beim Vergleich von Extrakten aus Zellen, die durch Mörtel und Stößel aufgeschlossen wurden, mit der Mühle zeigten sich vergleichbare Proteinkonzentrationen, wie sie durch BioRad Protein Assay mit einem BSA-Standard bestimmt wurden, und vergleichbare Konzentrationen von spleißosomalen snRNAs, wie sie durch Primerverlängerung ermittelt wurden (Daten nicht gezeigt).