Narušení buněk a biologické vzorky OD ROZRUŠOVÁNÍ BUNĚK AŽ PO HOMOGENIZACI A ROZMĚLŇOVÁNÍ NEJRŮZNĚJŠÍCH BIOLOGICKÝCH MATERIÁLŮ
Příprava biologických vzorků, jako jsou kosti, rostliny, svaly nebo sputum, pro analýzu DNA, RNA, proteinů nebo metabolitů může být náročná. Společnost RETSCH nabízí laboratorní mlýnky a drtiče, které rozmělňují a homogenizují pevné vzorky, ale jsou vhodné i pro rozrušování buněk. Mlýnky RETSCH se používají v oblastech, jako jsou biotechnologie, diagnostika, forenzní medicína, zemědělství a mikrobiologie.
Narušení buněk mikroorganismů (v suspenzi)
Příprava biologických vzorků, jako jsou kosti, rostliny, svaly nebo sputum, pro analýzu DNA, RNA, proteinů nebo metabolitů může být náročná. Společnost RETSCH nabízí laboratorní mlýnky a drtiče, které rozmělňují a homogenizují pevné vzorky, ale jsou vhodné i pro rozrušování buněk. Mlýnky RETSCH se používají v oblastech, jako jsou biotechnologie, diagnostika, forenzní medicína, zemědělství a mikrobiologie.
Oscilační mlýn MM 400 - narušení buněk kvasinek*
*Video ukazuje předchozí model s totožným funkčním principem.
Zvýšená reprodukovatelnost celkové koncentrace bílkovin po přerušení buněk, 7 min. v
MM 400, 12 min Vortex.
Chybové úsečky: % směrodatné odchylky
MM 400 zpracuje až 20 vzorků v 1,5 nebo 2 ml zkumavkách Eppendorf bez křížové kontaminace, což šetří čas obsluhy. Kromě toho je k dispozici adaptér, který pojme až osm 50 ml zkumavek Falcon. Optimální velikost kuliček pro rozrušení buněk se liší v závislosti na typu buněk; pro bakterie a kvasinky se doporučují skleněné kuličky v rozmezí 0,75 až 1,5 mm, zatímco pro houby a mikrořasy jsou vhodnější menší kuličky v rozmezí 0,1 až 0,5 mm.
Pro extrakci DNA nebo RNA jsou ideální menší zkumavky na jedno použití o objemu do 2 ml, zatímco pro zpracování proteinů nebo metabolitů jsou vhodné větší zkumavky, jako jsou 50ml zkumavky Falcon. Optimální parametry vyklepávání kuliček se liší podle typu buněk. K nalezení nejlepších výsledků může být třeba experimentovat. Obvykle je k úplnému rozrušení buněk zapotřebí 30 s (většina mikrořas) až 7 min (kvasinky obecně) šlehání kuliček.
Tím, že oscilační mlýn MM 500 vario pojme až padesát jednorázových lahviček o objemu 2 ml, účinně zvyšuje průchodnost vzorku.
Buňky Phaeodactylum tricornutum před (vlevo) a po rozrušení buněk (vpravo) pomocí oscilačního mlýnu MM 400 v kombinaci s adaptérem Falcon tube.
Řízení teploty pro rozdružování kuliček v buněčné suspenzi
Teplota hraje zásadní roli zejména v aplikacích, kde se jedná o proteiny citlivé na teplotu. Jedním řešením je kryogenní mletí (viz příslušná část), druhým je chlazení buněčné suspenze. U MM 400 se ukázalo, že nárůst tepla ve 2 ml zkumavkách je mírný i při 30 Hz; jednoduchým způsobem je přerušit doby přerušení >1 min chlazením adaptéru s lahvičkami v ledové lázni po dobu jedné minuty. Tímto způsobem se teplota udrží pod 12-15 °C v závislosti na použité velikosti kuliček.
Způsobem, jak kontrolovat vývoj teploty při rozdružování s pomocí kuliček, je použití Oscilačního mlýnu MM 500 control. Speciální adaptér pojme osmnáct 2 ml jednorázových lahviček na jednu dávku. Stroj je připojen k chladicímu zařízení s vodou chlazenou na 4 °C, které následně chladí adaptér držící ampulky. Tímto způsobem se udržuje teplota suspenze kolem 13 °C, ale bez nepříjemných fází ručního přerušování v ledové lázni. Zatímco MM 500 control neakceptuje jednorázový adaptér pro zkumavky Falcon, lze jej použít s nerezovými mlecími nádobkami o objemu 50, 80 nebo 125 ml (viz příklad vlevo: P. pastoris).
Pokud se mlýnek používá s kapalným dusíkem a zařízením CryoPad a je nastaven na teplotu 0 °C, lze teplotu buněčné suspenze ve 2 ml zkumavkách na jedno použití udržovat dokonce při teplotě 0 °C, aniž by došlo ke zmrazení suspenze, takže je stále možné účinné rozdružování pomocí kuliček.
Měřicí systém GrindControl GrindControl ukazuje, co se děje uvnitř mlecí nádoby – v reálném čase
GrindControl poskytuje přehled v reálném čase o procesech uvnitř mlecí nádoby. Tlak a teplota jsou neustále monitorovány – což zajišťuje bezpečnou a přesnou kontrolu, i u citlivých nebo reaktivních materiálů. Reagujte rychle na neočekávané tlakové špičky a neustále pečlivě sledujte vzorky citlivé na teplotu a dokonce i mechanochemické reakce.
GrindControl v kostce
- Data o tlaku a teplotě v reálném čase
- Včasné odhalení kritických podmínek
- Přesná řízení procesů
- Ochrana citlivých materiálů
- Reprodukovatelné výsledky
Homogenizace měkkých a tvrdých biologických vzorků
Některé biologické vzorky, například sputum pacientů s cystickou fibrózou nebo vzorky tkání, jako jsou játra, plíce nebo nádory, je někdy obtížnější plně homogenizovat. Dvoumililitrové zkumavky na jedno použití jsou často příliš malé na to, aby se do nich vešel celý objem vzorku, takže je nutné vzorek po procesu homogenizace rozdělit a znovu spojit, což přidává další práci a čas do laboratorní rutiny.
Do větších rozmělňovacích nádobek vyrobených například z nerezové oceli se vejde celý objem vzorku, ale je třeba je po každém použití vyčistit. Adaptér pro oscilační mlýn MM 400 tento problém řeší tím, že umožňuje použití jednorázových zkumavek o objemu 5 x 5 ml, které mají větší kapacitu a nevyžadují čištění. V jedné dávce lze homogenizovat 10 vzorků současně. K homogenizaci vzorků tkání lze použít také 50 ml zkumavky Falcon. Zde lze zpracovat 8 vzorků na dávku během pouhých několika minut.
Vzorek jater před a po homogenizaci v MM 400
Kryogenní mletí biologických vzorků
Některé biologické vzorky, jako jsou vláknité rostliny, tuhé žíly, nehty nebo některé živočišné či nádorové tkáně, se v pufrovacím systému obtížně homogenizují. Jsou buď příliš měkké, nebo příliš tvrdé, nebo příliš vláknité, než aby je bylo možné účinně rozmělnit v suspenzi. Lepší alternativou pro tyto vzorky je kryogenní mletí, které zahrnuje jejich zmrazení kapalným dusíkem před nebo během procesu mletí. Díky této technice jsou vzorky křehké a lze je snadno rozdrtit na homogenní prášek. Kryogenní mletí má také tu výhodu, že zachovává integritu např. proteinů nebo těkavých látek, které by se mohly při vyšších teplotách rozkládat nebo odpařovat. Kryogenní mletí navíc může rozbít nitrobuněčné organely některých organismů, např. kvasinek.
U vzorků, které jsou lepkavé, jako jsou bobule, je kryogenní mletí často jedinou možnou metodou, jak získat rovnoměrný vzorek. V tabulce jsou uvedeny některé příklady vzorků materiálů, které byly úspěšně zpracovány kryogenním mletím v mlýně oscilačním mlýně MM 400 nebo v mlýně CryoMill. Pro kryogenní mletí v mlýně MM 400 lze použít 2 ml ocelové zkumavky. Podobných účinků lze dosáhnout MM 500 control s mlecími nádobkami o objemu až 125 ml pro větší objemy vzorků. Zde se pro práci s kapalným dusíkem musí použít podložka CryoPad. Ve všech uvedených mlýncích jsou k dispozici také 2 ml nerezové zkumavky a příslušné adaptéry pro menší objemy vzorků.
| Vzorek | Příslušenství | Vstupní množství | Doba mletí | Rychlost | Maximální výstupní velikost zrna (d90)/ Výsledky vyhledávání |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli bakterie |
|
2 x 10 ml zmrazených buněčných pelet | 2 min | 30 Hz | úplné narušení buněk |
| svalová tkáň |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | 150 µm |
| borové jehličí |
|
2 jehly na lahvičku | 3 min | 30 Hz | Reprodukovatelná extrakce RNA 20 vzorků v jednom kroku |
| bobule |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| nehty na rukou |
|
1 nehet na ampulku | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| krysí střeva |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
před a po kryogenním mletí
před a po kryogenním mletí
Reliable RNA Detection in Mosquito Surveillance – Efficient, Reproducible, Temperature-Controlled
Surveillance laboratories face a dual challenge: thousands of mosquito pools must be screened for viral RNA every season – rapidly, reliably, and without loss of sample quality. Mechanical homogenization generates frictional heat that irreversibly damages RNA and leads to false-negative PCR results. With the MM 500 control, up to 36 mosquito pools can be homogenized simultaneously at a constant temperature below 15 °C – without a single manual interruption. An aluminium adapter transfers the chiller cooling directly to 18 Eppendorf tubes per grinding station; single-use reaction vessels reliably prevent cross-contamination. Up to 12 stored SOPs standardize the process across the entire season, regardless of the operator.
Recommendations for Practice
Freeze samples immediately after collection, as RNA degradation begins within minutes at room temperature; stainless steel balls (2–3 mm) at 25-28 Hz and 45-60 seconds grinding time have proven effective and can be saved directly as an SOP on the instrument. Laboratories operating under GLP requirements benefit from the optional GrindControl system for seamless real-time documentation of temperature and pressure.
Forenzní vzorky
Forenzní vzorky, jako jsou vlasy, kosti a zuby, jsou většinou křehké, a proto je obvykle není třeba před rozmělněním chladit. Pro dosažení požadované analytické jemnosti může být nutné vzorky předběžně rozdrtit v čelisťovém drtiči nebo střižném mlýně, aby se velikost částic snížila na méně než 10 mm pro další zpracování v kulovém mlýně. Střižné mlýny se používají k předběžnému drcení kostí, které mohou být čerstvé, a tudíž ne zcela suché, a mohou dokonce obsahovat zbytky masa.
Společnost RETSCH nabízí řadu střižných mlýnů pro primární zmenšování velikosti měkkých, středně tvrdých, pružných, houževnatých a vláknitých materiálů vzorků. Široká škála příslušenství umožňuje optimální přizpůsobení různým aplikacím. Mlýn SM 300 lze vybavit třemi různými rotory a spodními síty od 0,25 mm do 20 mm. Na rozdíl od čerstvých a tukových kostí lze suché kosti zmenšit na velikost menší než 0,25 mm v jednom nebo dvou krocích. Model SM 300 má variabilní otáčky od 100 do 3 000 ot/min. Rozmělňování kostí nebo zubů či chlupů se většinou provádí v kulových mlýnech s použitím mlecích koulí > 5 mm z oceli, oxidu zirkoničitého nebo karbidu wolframu.
Promývací postup pro získání neporušených bakteriálních buněk z lidské tkáně
Jednou z možných komplikací operací kloubních náhrad, jako jsou například lokty nebo kolena, je infekce okolní tkáně různými bakteriemi. Tyto infekce, nazývané protetické kloubní infekce (PJI), se mohou objevit kdykoli od několika dnů až po několik let po operaci. Jejich léčba je obtížná, protože je mohou způsobovat různé typy bakterií a ne vždy jsou odhaleny běžnými metodami. Proto je nutné izolovat bakterie ze vzorků tkání způsobem, který zachová jejich životaschopnost a umožní jejich identifikaci a kultivaci.
V tomto případě může pomoci jednoduchý postup, který provádí Oscilační mlýn MM 400 Vzorky se smíchají s 20 ml sterilní demineralizované vody a 5 ml skleněných kuliček o průměru 1 mm ve sterilizované ocelové nádobě. Lze použít jednorázové 30 ml lahvičky se širokým hrdlem. Až 8 lahviček se protřepává po dobu 3,5 min při frekvenci 30 Hz, aby se ze vzorků odstranily bakterie, aniž by se zničily. Bakterie lze poté snadno kultivovat na agarové plotně pro další analýzu. Tato metoda má vysokou míru detekce (A.-L. Roux et. al 2010) a lze ji použít na jakýkoli pevný vzorek infikované tkáně, i když obsahuje implantovaný materiál.
Vhodné mlýnky pro rozrušování buněk a homogenizaci vzorků
Získejte více informací z našich bílých brožurek a článků
Cell disruption of parasites with Bead Beating
Giardia and Cryptosporidia are parasites which occur in water and can cause diarrhoea in humans. They are persistent forms found in water and are resistant to environmental influences and disinfectants. Detection and quantitative determination of the parasites are typically performed in accordance with ISO 15553 „Water Quality – Isolation and Enumeration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water“. A German microbiological laboratory has now tested a mechanical approach by using RETSCH’s Mixer Mill MM 400 for bead beating.
Cryogenic Disruption of Yeast Cells
At the Ernst Ruska-Centre-3 (ER-C-3) for Microscopy and Spectroscopy with Electrons, one of the institutes of the renowned Forschungszentrum Jülich, researchers harness the power of cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography to answer important questions regarding the structure and function of biological membranes and membrane-associated protein complexes. To this end, various cellular systems, including yeast, are used as models to study the membrane systems of interest.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
The Michael Rout Lab at the Rockefeller University in New York, NY, initially contacted RETSCH Inc. in 2006 to discuss the possibility of using the Planetary Ball Mill to cryogenically grind yeast cell pellets. The aim of their experiment was to explore the construct of Nuclear Pore Complexes located on the cell walls of yeast cells. The decision to use a Planetary Ball Mill for this application was mainly based on the fact that it produces very small particle sizes which were considered an important prerequisite for more in-depth analysis of the yeast cells.
Prosthetic joint infections: New method allows for diagnostics of up to 8 samples with high documentation rate
One of the major risks of a joint replacement is prosthetic joint infection (PIJ), a bacterial infection at the interface of implant, tissue, and bone. In 2010, A.-L. Roux et al. published an article titled „Diagnosis of prosthetic joint infection by beadmill processing of a periprosthetic specimen.“ It describes a new diagnosis method of involved microbes, with an impressive documentation rate of more than 83% and, at the same time, a very low contamination rate of 8.7%. The method involves washing the microbes off the tissue samples in a RETSCH Mixer Mill within 210 seconds.
Temperature-controlled preparation of biochemical samples
The temperature plays an important role in biochemical analyses. To ensure that the properties of biological samples are not altered during sample preparation, it is necessary to continuously cool or sometimes even freeze the sample material. This application article describes how the Mixer Mill MM 500 control with its possibilities of temperature-controlled sample processing is used for preparing biochemical samples. As an application example, we present the cell disruption process of a global pharmaceutical and diagnostics company.
What Hair Reveals
The detection of illegal drugs and pharmaceuticals plays a role in various fields, for example in forensic science, road traffic accidents, in competitive sports or at the workplace. Hair has the great advantage of storing the substances for a long period, which means that detection is still possible several months after consumption of the drug. In addition to the detection of drugs, hair samples are also used for DNA analysis as well as for the analysis of heavy metals and minerals.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
The Michael Rout Lab at the Rockefeller University in New York, NY, initially contacted RETSCH Inc. in 2006 to discuss the possibility of using the Planetary Ball Mill to cryogenically grind yeast cell pellets. The aim of their experiment was to explore the construct of Nuclear Pore Complexes located on the cell walls of yeast cells. The decision to use a Planetary Ball Mill for this application was mainly based on the fact that it produces very small particle sizes which were considered an important prerequisite for more in-depth analysis of the yeast cells.
Homogenization of tough biological secretions or tissue pieces
Sometimes the preparation and homogenization of biological samples can be as tough as the material itself. The widely used 2 ml single-use Eppendorf tubes are often not large enough to accommodate the whole sample volume; hence, the sample needs to be divided and reunited after the homogenization process which means an additional time-consuming working step in the lab routine. While it is true that usually larger sized grinding jars, e. g. of stainless steel, are available which accommodate the complete sample volume, these have the drawback of requiring cleaning after use.
White Paper: Important Aspects of Sample Preparation of Biological Materials
Biological samples exist in all shapes and sizes: hard bones, tough and fibrous plants, tough and viscous sputum, soft muscles, tumor or liver tissue. Not to mention the millions of cells such as yeast, bacteria or algae, which have to be disrupted for applications such as DNA or RNA isolation or protein extraction. Retsch offers a range of mills and grinders for easy and reproducible pulverization of solid sample materials some of which are also suitable for cell disruption and homogenization of biological sample materials.
Kontaktujte nás pro bezplatnou konzultaci
Produkty a služby RETSCH jsou dostupné prostřednictvím globální sítě dceřiných společností a plně vyškolených distributorů. Naši zaměstnanci vám rádi pomohou s případnými dotazy.
Narušení buněk a biologické vzorky - časté dotazy
Co je to míchání kuliček pro rozrušení buněk?
Pro extrakci buněčných složek z mikroorganismů, jako jsou bakterie, kvasinky, houby nebo mikrořasy, je rozhodující míchání kuliček, což je mechanická metoda široce používaná k míchání buněk. Tento proces zahrnuje použití kuliček ke střihání buněk v suspenzi a může být prováděn v různém rozsahu pomocí různých lahviček a zkumavek. Automatizace, kterou poskytují oscilační mlýnky RETSCH s adaptéry, zefektivňuje proces míchání kuliček a zajišťuje jeho rychlost, účinnost a reprodukovatelnost.
Optimální velikost a parametry kuliček závisí na typu buněk, což vyžaduje experimentování pro dosažení nejlepších výsledků. Například přístroj MM 400 dokáže zpracovat až 20 vzorků v 1,5 nebo 2 ml zkumavkách Eppendorf bez křížové kontaminace. Dostupný adaptér umožňuje umístit až osm 50 ml zkumavek Falcon, což zvyšuje univerzálnost procesu.
Kdy použít kryogenní mletí?
Kryogenní mletí je nezbytné při zpracování náročných vzorků, které odolávají homogenizaci v běžných pufrovacích systémech. To platí zejména pro vláknité rostliny, tvrdé žíly, nehty nebo specifické živočišné či nádorové tkáně. Tato technika zahrnuje použití kapalného dusíku ke zmrazení vzorků buď před, nebo během procesu mletí. Toto kryogenní zmrazení činí vzorky křehkými, což usnadňuje jejich drcení na homogenní prášek.
Proces kryogenního mletí má výrazné výhody, protože zachovává integritu proteinů nebo těkavých látek, které by se při vyšších teplotách mohly rozkládat nebo odpařovat. Kromě toho se ukazuje jako účinný při rozbíjení intracelulárních organel v některých organismech. Kryogenní mletí je zejména jedinou možnou metodou pro získání jednotných vzorků lepkavých materiálů, jako jsou bobule.
Pro dosažení optimálních výsledků lze kryogenní mletí provádět pomocí specializovaného zařízení, jako je CryoMill nebo Mixer Mill MM 400, které pojme 2 ml ocelové zkumavky. Řídicí zařízení Mixer Mill MM 500, které je speciálně navrženo pro práci s kapalným dusíkem (LN2), pojme větší mlecí nádobky o objemu až 125 ml.
Výběr ideálních mlýnů pro drcení forenzních vzorků, jako jsou kosti a vlasy
Pokud jde o drcení forenzních vzorků, jako jsou kosti nebo zuby, jsou optimální volbou pro první krok procesu zmenšování velikosti čelistní drtiče nebo střižné mlýny. Společnost RETSCH nabízí rozmanitou řadu střižných mlýnů určených k primárnímu zmenšení velikosti různých materiálů vzorků, včetně měkkých, středně tvrdých, pružných, houževnatých a vláknitých látek. Rozsáhlá nabídka příslušenství zajišťuje, že tyto mlýny lze bez problémů přizpůsobit různým aplikacím.
Například všestranný mlýnek SM 300 se může pochlubit třemi různými rotory a spodními síty v rozsahu od 0,25 mm do 20 mm spolu s variabilními otáčkami od 100 do 3 000 ot/min. Tato flexibilita z něj činí vynikající nástroj pro přizpůsobení specifickým potřebám zpracování forenzních vzorků.
Pro následné kroky zpracování zvažte využití kulových mlýnů vybavených mlecími koulemi většími než 5 mm, vyrobenými z materiálů, jako je ocel, oxid zirkoničitý nebo karbid wolframu. Pro rozmělnění vlasů jsou nejlepší volbou oscilační mlýny, jako je MM 400.