Campioni biologici e distruzione cellulare DALLA DISGREGAZIONE DELLE CELLULE ALL'OMOGENEIZZAZIONE E ALLA POLVERIZZAZIONE DI UN'AMPIA VARIETÀ DI MATERIALI BIOLOGICI.
La preparazione di campioni biologici come ossa, piante, muscoli o espettorato per l'analisi di DNA, RNA, proteine o metaboliti può essere una sfida. RETSCH fornisce mulini da laboratorio che polverizzano e omogeneizzano i campioni solidi, ma sono anche adatti alla disgregazione cellulare. I mulini RETSCH sono utilizzati in settori quali biotecnologia, diagnostica, medicina legale, agricoltura e microbiologia.
Distruzione cellulare di microrganismi (in sospensione)
La preparazione di campioni biologici come ossa, piante, muscoli o espettorato per l'analisi di DNA, RNA, proteine o metaboliti può essere una sfida. RETSCH fornisce mulini da laboratorio che polverizzano e omogeneizzano i campioni solidi, ma sono anche adatti alla disgregazione cellulare. I mulini RETSCH sono utilizzati in settori quali biotecnologia, diagnostica, medicina legale, agricoltura e microbiologia.
Vibro Mulino MM 400 - Distruzione delle cellule di lievito*
*Il video mostra il modello precedente con lo stesso principio funzionale.
Aumento della riproducibilità della concentrazione di proteine totali dopo la rottura delle cellule, 7 min con
MM 400, 12 min Vortex.
Barre di errore: % di deviazione standard
Il Vibro Mulino MM 400 elabora fino a 20 campioni in provette Eppendorf da 1,5 o 2 ml senza contaminazione incrociata, risparmiando tempo all'operatore. Inoltre, è disponibile un adattatore per ospitare fino a otto provette Falcon da 50 ml. Le dimensioni ottimali delle microsfere per la disgregazione cellulare variano in base al tipo di cellula; per i batteri e i lieviti si consigliano microsfere di vetro da 0,75 a 1,5 mm, mentre per i funghi e le microalghe sono più adatte microsfere più piccole da 0,1 a 0,5 mm.
Per l'estrazione del DNA o dell'RNA, sono ideali le provette monouso più piccole, fino a 2 ml, mentre le fiale più grandi, come le provette Falcon da 50 ml, sono adatte al trattamento di proteine o metaboliti. I parametri ottimali di battitura delle microsfere variano a seconda del tipo di cellula. Potrebbe essere necessario fare qualche esperimento per trovare i risultati migliori. In genere, sono necessari da 30 s (per la maggior parte delle microalghe) a 7 min (per i lieviti in generale) di battitura delle microsfere per disgregare completamente le cellule.
Accettando fino a cinquanta fiale monouso da 2 ml, il Vibro Mulino MM 500 vario aumenta efficacemente la produttività dei campioni.
Cellule di Phaeodactylum tricornutum prima (a sinistra) e dopo la disgregazione cellulare (a destra) con il Vibro Mulino MM 400 in combinazione con l'adattatore per provette Falcon.
Controllo della temperatura per il battito delle microsfere in sospensione cellulare
La temperatura gioca un ruolo cruciale, soprattutto nelle applicazioni in cui sono coinvolte proteine sensibili alla temperatura. Una soluzione è la macinazione criogenica (vedi sezione corrispondente), l'altra è il raffreddamento della sospensione cellulare. Per l'MM 400 stato dimostrato che l'aumento di calore nelle provette da 2 ml è moderato anche a 30 Hz; un modo semplice è quello di interrompere i tempi di interruzione >1 minuto raffreddando l'adattatore con le provette in un bagno di ghiaccio per un minuto. In questo modo, la temperatura rimarrà al di sotto dei 12-15°C, a seconda delle dimensioni delle microsfere utilizzate.
Un modo per controllare l'andamento della temperatura nella battitura delle microsfere è l'utilizzo del Vibro Mulino MM 500 Control. Ano speciale adattatore ospita diciotto fiale monouso da 2 ml per lotto. La macchina è collegata a un refrigeratore con acqua raffreddata a 4°C che a sua volta raffredda l'adattatore che contiene le fiale. In questo modo, la temperatura della sospensione viene mantenuta a circa 13°C, ma senza le scomode fasi di interruzione manuale in un bagno di ghiaccio. MM 500 Control non accetta l'adattatore monouso per provette Falcon, ma può essere utilizzato con giare di macinazione in acciaio inox da 50, 80 o 125 ml (vedi esempio a sinistra: P. pastoris).
Se il mulino viene utilizzato con azoto liquido e CryoPad e impostato su una temperatura di 0 °C, la temperatura della sospensione cellulare in provette monouso da 2 ml può essere mantenuta a 0 °C senza congelare la sospensione, in modo che sia ancora possibile un battito efficace delle microsfere.
Sistema di misurazione GrindControl GrindControl mostra cosa sta succedendo all'interno del barattolo di levigatura, in tempo reale
GrindControl fornisce visibilità in tempo reale sui processi all'interno del mortaio di levigatura. Pressione e temperatura sono monitorate continuamente, garantendo un controllo sicuro e preciso, anche con materiali sensibili o reattivi. Rispondi prontamente a improvvisi picchi di pressione e tieni d'occhio costantemente i campioni sensibili alla temperatura e persino le reazioni meccanochimiche.
GrindControl in un colpo d'occhio
- Dati in tempo reale su pressione e temperatura
- Rilevazione precoce di condizioni critiche
- Controllo di processo preciso
- Protezione dei materiali sensibili
- Risultati riproducibili
Omogeneizzazione di campioni biologici morbidi e difficili
Alcuni campioni biologici, come l'espettorato di pazienti affetti da fibrosi cistica o campioni di tessuto come fegato, polmoni o tumori, sono talvolta più difficili da omogeneizzare completamente. Le provette monouso da 2 ml sono spesso troppo piccole per contenere l'intero volume del campione, quindi il campione deve essere diviso e ricombinato dopo il processo di omogeneizzazione, il che aggiunge ulteriore lavoro e tempo alla routine di laboratorio.
Le giare di macinazione più grandi in acciaio inossidabile, ad esempio, possono contenere l'intero volume del campione, ma devono essere puliti dopo ogni utilizzo. Un adattatore per il Vibro Mulino MM 400 risolve questo problema consentendo l'uso di provette monouso da 5 x 5 ml, che hanno una maggiore capacità e non richiedono la pulizia. Per ogni lotto, è possibile omogeneizzare 10 campioni contemporaneamente. Le provette Falcon da 50 ml possono essere utilizzate anche per omogeneizzare i campioni di tessuto. In questo caso, 8 campioni per lotto possono essere processati in pochi minuti.
Campione di fegato prima e dopo l'omogeneizzazione con MM 400
Macinazione criogenica di campioni biologici
Alcuni campioni biologici, come piante fibrose, vene dure, unghie o alcuni tessuti animali o tumorali, sono difficili da omogeneizzare in un sistema tampone. Sono troppo morbidi, troppo duri o troppo fibrosi per essere polverizzati efficacemente in sospensione. Un'alternativa migliore per questi campioni è la macinazione criogenica, che prevede il congelamento con azoto liquido prima o durante il processo di macinazione. Questa tecnica rende i campioni fragili e facili da frantumare in polveri omogenee. La macinazione criogenica ha anche il vantaggio di preservare l'integrità, ad esempio, delle proteine o dei composti volatili che potrebbero degradarsi o evaporare a temperature più elevate. Inoltre, la macinazione criogenica può rompere gli organelli intracellulari di alcuni organismi, come il lievito.
Per i campioni appiccicosi, come le bacche, la macinazione criogenica è spesso l'unico metodo possibile per ottenere un campione uniforme. La tabella elenca alcuni esempi di campioni che sono stati trattati con successo mediante macinazione criogenica nel Vibro Mulino MM 400 o nel CryoMill. Per la macinazione criogenica nell'MM 400 si possono utilizzare provette in acciaio da 2 ml. Effetti simili possono essere ottenuti nel Vibro Mulino MM 500 control con giare di macinazione fino a 125 ml per volumi maggiori. In questo caso è possibile utilizzare il CryoPad per lavorare con azoto liquido. In tutti i mulini citati, sono disponibili anche tubi in acciaio inox da 2 ml e relativi adattatori per volumi più piccoli.
| Campione | Accessori | Quantità in ingresso | Tempo di macinazione | Velocità | Max finezza finale (d90)/ Risultati |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli batteri |
|
2 pellet di cellule congelate da 10 ml | 2 min | 30 Hz | completa distruzione cellulare |
| tessuto muscolare |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | 150 µm |
| aghi di pino |
|
2 aghi per fiala | 3 min | 30 Hz | Estrazione riproducibile dell'RNA di 20 campioni in un unico passaggio |
| bacche |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| unghie delle mani |
|
1 unghia per fiala | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| intestino di topo |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
prima e dopo la macinazione criogenica
prima e dopo la macinazione criogenica
Rilevamento affidabile di RNA nella sorveglianza delle zanzare – Efficiente, Riproducibile, Controllato in Temperatura
I laboratori di sorveglianza affrontano una doppia sfida: Migliaia di pozze di zanzare devono essere sottoposte a screening per RNA virale ogni stagione – rapidamente, in modo affidabile e senza perdita di qualità del campione. L'omogeneizzazione meccanica genera calore da attrito che danneggia irreversibilmente l'RNA e porta a risultati PCR falsi negativi. Con l'MM 500 control, fino a 36 pozze di zanzare possono essere omogeneizzate contemporaneamente a una temperatura costante inferiore a 15 °C – senza alcuna interruzione manuale. Un adattatore in alluminio trasferisce il raffreddamento del chiller direttamente a 18 tubi Eppendorf per stazione di levigatura; i contenitori di reazione monouso prevengono in modo affidabile la contaminazione incrociata. Fino a 12 SOP memorizzati standardizzano il processo per l'intera stagione, indipendentemente dall'operatore.
Raccomandazioni per la Pratica
Congelare immediatamente i campioni dopo la raccolta, poiché la degradazione dell'RNA inizia entro pochi minuti a temperatura ambiente; palline in acciaio inossidabile (2-3 mm) a 25-28 Hz e tempo di levigatura di 45-60 secondi si sono dimostrate efficaci e possono essere salvate direttamente come SOP sull'strumento. I laboratori che operano in conformità con i requisiti GLP beneficiano del sistema opzionale GrindControl per una documentazione in tempo reale e senza interruzioni di temperatura e pressione.
Campioni forensi
I campioni forensi come capelli, ossa e denti sono per lo più fragili e quindi non necessitano di raffreddamento prima della polverizzazione. Per ottenere la finezza analitica desiderata, i campioni possono essere sottoposti a una frantumazione preliminare in un Frantoio a mascelle o in un Mulino a Taglienti per ridurre le dimensioni delle particelle al di sotto dei 10 mm per la successiva lavorazione in un Mulino a Sfere. I mulini a taglienti sono utilizzati per la pre-frantumazione di ossa che possono essere fresche e quindi non completamente asciutte e possono anche contenere residui di carne.
RETSCH offre una gamma di mulini a taglienti per la riduzione primaria delle dimensioni di materiali morbidi, medio-duri, elastici, tenaci e fibrosi. L'ampia gamma di accessori consente un adattamento ottimale alle varie applicazioni. Il mulino a taglienti SM 300 può essere dotato di tre diversi rotori e setacci inferiori da 0,25 mm a 20 mm. A differenza delle ossa fresche e grasse, le ossa secche possono essere ridotte a una dimensione inferiore a 0,25 mm in una o due fasi. L'SM 300 ha una velocità variabile da 100 a 3.000 giri/min. La polverizzazione di ossa, denti o peli avviene per lo più in mulini a sfere che utilizzano sfere > 5 mm in acciaio, ossido di zirconio o carburo di tungsteno.
Procedura di lavaggio per ottenere cellule batteriche intatte da tessuto umano
Una delle potenziali complicazioni di un intervento di sostituzione dell'articolazione, come nel caso di gomiti o ginocchia, è l'infezione dei tessuti circostanti da parte di vari batteri. Queste infezioni, chiamate infezioni articolari protesiche (PJI), possono verificarsi da pochi giorni a diversi anni dopo l'intervento. Sono difficili da trattare perché possono essere causate da diversi tipi di batteri e non sempre vengono individuate con i metodi convenzionali. Pertanto, è necessario isolare i batteri dai campioni di tessuto in modo da preservarne la vitalità e consentirne l'identificazione e la coltivazione.
È qui che il Vibro Mulino MM 400 può aiutare con una semplice procedura: I campioni vengono mescolati con 20 ml di acqua demineralizzata sterile e 5 ml di microsfere di vetro da 1 mm in una giara di acciaio sterilizzato. È possibile utilizzare bottiglie monouso a bocca larga da 30 ml. 8 bottiglie vengono agitate per 3,5 minuti a 30 Hz per rimuovere i batteri dai campioni senza distruggerli. I batteri possono quindi essere facilmente coltivati su una piastra di agar per ulteriori analisi. Questo metodo ha un'alta percentuale di rilevamento (A.-L. Roux et. al 2010) e può essere applicato a qualsiasi campione di tessuto solido infetto, anche se contiene materiale impiantato.
Mulini adatti per la disgregazione cellulare e l'omogeneizzazione dei campioni
Approfondisci le tue conoscenze con i nostri white paper e articoli
Cell disruption of parasites with Bead Beating
Giardia and Cryptosporidia are parasites which occur in water and can cause diarrhoea in humans. They are persistent forms found in water and are resistant to environmental influences and disinfectants. Detection and quantitative determination of the parasites are typically performed in accordance with ISO 15553 „Water Quality – Isolation and Enumeration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water“. A German microbiological laboratory has now tested a mechanical approach by using RETSCH’s Mixer Mill MM 400 for bead beating.
Cryogenic Disruption of Yeast Cells
At the Ernst Ruska-Centre-3 (ER-C-3) for Microscopy and Spectroscopy with Electrons, one of the institutes of the renowned Forschungszentrum Jülich, researchers harness the power of cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography to answer important questions regarding the structure and function of biological membranes and membrane-associated protein complexes. To this end, various cellular systems, including yeast, are used as models to study the membrane systems of interest.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
The Michael Rout Lab at the Rockefeller University in New York, NY, initially contacted RETSCH Inc. in 2006 to discuss the possibility of using the Planetary Ball Mill to cryogenically grind yeast cell pellets. The aim of their experiment was to explore the construct of Nuclear Pore Complexes located on the cell walls of yeast cells. The decision to use a Planetary Ball Mill for this application was mainly based on the fact that it produces very small particle sizes which were considered an important prerequisite for more in-depth analysis of the yeast cells.
Prosthetic joint infections: New method allows for diagnostics of up to 8 samples with high documentation rate
One of the major risks of a joint replacement is prosthetic joint infection (PIJ), a bacterial infection at the interface of implant, tissue, and bone. In 2010, A.-L. Roux et al. published an article titled „Diagnosis of prosthetic joint infection by beadmill processing of a periprosthetic specimen.“ It describes a new diagnosis method of involved microbes, with an impressive documentation rate of more than 83% and, at the same time, a very low contamination rate of 8.7%. The method involves washing the microbes off the tissue samples in a RETSCH Mixer Mill within 210 seconds.
Temperature-controlled preparation of biochemical samples
The temperature plays an important role in biochemical analyses. To ensure that the properties of biological samples are not altered during sample preparation, it is necessary to continuously cool or sometimes even freeze the sample material. This application article describes how the Mixer Mill MM 500 control with its possibilities of temperature-controlled sample processing is used for preparing biochemical samples. As an application example, we present the cell disruption process of a global pharmaceutical and diagnostics company.
What Hair Reveals
The detection of illegal drugs and pharmaceuticals plays a role in various fields, for example in forensic science, road traffic accidents, in competitive sports or at the workplace. Hair has the great advantage of storing the substances for a long period, which means that detection is still possible several months after consumption of the drug. In addition to the detection of drugs, hair samples are also used for DNA analysis as well as for the analysis of heavy metals and minerals.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
The Michael Rout Lab at the Rockefeller University in New York, NY, initially contacted RETSCH Inc. in 2006 to discuss the possibility of using the Planetary Ball Mill to cryogenically grind yeast cell pellets. The aim of their experiment was to explore the construct of Nuclear Pore Complexes located on the cell walls of yeast cells. The decision to use a Planetary Ball Mill for this application was mainly based on the fact that it produces very small particle sizes which were considered an important prerequisite for more in-depth analysis of the yeast cells.
Homogenization of tough biological secretions or tissue pieces
Sometimes the preparation and homogenization of biological samples can be as tough as the material itself. The widely used 2 ml single-use Eppendorf tubes are often not large enough to accommodate the whole sample volume; hence, the sample needs to be divided and reunited after the homogenization process which means an additional time-consuming working step in the lab routine. While it is true that usually larger sized grinding jars, e. g. of stainless steel, are available which accommodate the complete sample volume, these have the drawback of requiring cleaning after use.
White Paper: Important Aspects of Sample Preparation of Biological Materials
Biological samples exist in all shapes and sizes: hard bones, tough and fibrous plants, tough and viscous sputum, soft muscles, tumor or liver tissue. Not to mention the millions of cells such as yeast, bacteria or algae, which have to be disrupted for applications such as DNA or RNA isolation or protein extraction. Retsch offers a range of mills and grinders for easy and reproducible pulverization of solid sample materials some of which are also suitable for cell disruption and homogenization of biological sample materials.
Ci contatti per una consulenza gratuita
Grazie alla sua fitta rete internazionale composta da filiali, agenzie locali e società satellite, RETSCH è presente in più di 80 paesi garantendo elevati standard qualitativi e di competenza tecnica. Nei nostri laboratori applicativi, utilizzatori e potenziali clienti possono processare GRATUITAMENTE i propri campioni, in modo da poter valutare l'idoneità di sistemi proposti, prima di un eventuale acquisto. Le prove effettuate saranno inoltre accompagnate da un report di macinazione, riportante tutte le informazioni inerenti la prova (setting strumentali, strumenti ed accessori utilizzati)
Campioni biologici e distruzione cellulare - FAQ
Che cos'è il bead beating per la disgregazione cellulare?
Il bead beating un metodo meccanico ampiamente utilizzato per la disgregazione delle cellule, è fondamentale per estrarre componenti cellulari da microrganismi come batteri, lieviti, funghi o microalghe. Questo processo implica l'uso di microsfere per tagliare le cellule in una sospensione e può essere condotto su scale diverse utilizzando fiale e tubi diversi. L'automazione fornita dai mulini miscelatori RETSCH con adattatori ottimizza il processo di battitura delle microsfere, assicurando che sia veloce, efficiente e riproducibile.
La dimensione ottimale delle microsfere e i parametri dipendono dal tipo di cellula e richiedono una sperimentazione per ottenere i risultati migliori. L'MM 400, ad esempio, può processare fino a 20 campioni in provette Eppendorf da 1,5 o 2 ml senza contaminazione incrociata. Un adattatore disponibile consente di alloggiare fino a otto provette Falcon da 50 ml, aumentando la versatilità del processo.
Quando utilizzare la macinazione criogenica?
La macinazione criogenica diventa essenziale quando si trattano campioni difficili che resistono all'omogeneizzazione nei sistemi di tamponamento convenzionali. Ciò è particolarmente vero per le piante fibrose, le vene dure, le unghie o specifici tessuti animali o tumorali. La tecnica prevede l'applicazione di azoto liquido per congelare i campioni prima o durante il processo di macinazione. Il congelamento criogenico rende i campioni fragili, facilitando la loro frantumazione in polveri omogenee.
Il processo di macinazione criogenica offre notevoli vantaggi, preservando l'integrità delle proteine o dei composti volatili che potrebbero degradarsi o evaporare a temperature più elevate. Inoltre, si dimostra efficace nella disgregazione degli organelli intracellulari in alcuni organismi. In particolare, la macinazione criogenica è l'unico metodo praticabile per ottenere campioni uniformi di materiali appiccicosi, come le bacche.
Per ottenere risultati ottimali, la macinazione criogenica può essere effettuata utilizzando apparecchiature specializzate come il CryoMill o il Mixer Mill MM 400, che può ospitare tubi di acciaio da 2 ml. Il Mixer Mill MM 500 control, progettato specificamente per lavorare con l'azoto liquido (LN2), accetta giare di macinazione più grandi, fino a 125 ml.
Scelta dei mulini ideali per la polverizzazione di campioni forensi come ossa e capelli
Quando si tratta di polverizzare campioni forensi come ossa o denti, i frantoi a mascelle o i mulini da taglio sono la scelta ottimale per la prima fase del processo di riduzione delle dimensioni. RETSCH fornisce una vasta gamma di mulini da taglio progettati per la riduzione primaria delle dimensioni di una varietà di materiali campione, tra cui sostanze morbide, mediamente dure, elastiche, resistenti e fibrose. L'ampia gamma di accessori assicura che questi mulini possano essere adattati alle varie applicazioni senza problemi.
Il versatile SM 300, ad esempio, vanta tre diversi rotori e setacci inferiori da 0,25 mm a 20 mm, oltre a una velocità variabile da 100 a 3.000 giri/min. Questa flessibilità lo rende uno strumento eccellente per adattarsi alle specifiche esigenze di trattamento dei campioni forensi.
Per le fasi di lavorazione successive, si consiglia di utilizzare mulini a sfere dotati di sfere di dimensioni superiori a 5 mm, realizzate con materiali come acciaio, ossido di zirconio o carburo di tungsteno. Per la polverizzazione dei capelli, i mulini come l'MM 400 sono la scelta migliore.