Disrupción celular: métodos y procesos Desde la disrupción celular hasta la pulverización y homogeneización de muestras biológicas
La preparación de muestras biológicas como huesos, plantas, músculos o esputo para el análisis de ADN, ARN, proteínas o metabolitos puede ser un desafío. RETSCH ofrece molinos de laboratorio que pulverizan y homogeneizan muestras sólidas, pero que también son adecuados para la disrupción celular. Los molinos RETSCH se utilizan en áreas como la biotecnología, el diagnóstico, la medicina forense, la agricultura y la microbiología.
Disrupción celular de microorganismos (en suspensión)
La preparación de muestras biológicas como huesos, plantas, músculos o esputo para el análisis de ADN, ARN, proteínas o metabolitos puede ser un desafío. RETSCH ofrece molinos de laboratorio que pulverizan y homogeneizan muestras sólidas, pero que también son adecuados para la disrupción celular. Los molinos RETSCH se utilizan en áreas como la biotecnología, el diagnóstico, la medicina forense, la agricultura y la microbiología.
Molino Mezclador MM 400 - Ruptura celular de levadura*
*El vídeo muestra el modelo anterior con el mismo principio de funcionamiento.
Aumento de la reproducibilidad de la concentración total de proteínas tras la disrupción celular, 7 min. en el MM 400, 12 min. en un vortex; barras de error: % desviación estándar
Células de Phaeodactylum tricornutum antes (izquierda) y después de la disrupción celular (derecha) con el molino mezclador MM 400 en combinación con el adaptador para tubos Falcon.
Control de la temperatura para el bead beating en suspensión celular
La temperatura desempeña un papel crucial, especialmente en aplicaciones que involucran proteínas sensibles a la temperatura. Una solución es la trituración criogénica (véase la sección correspondiente), la otra es el enfriamiento de la suspensión celular.
Para el MM 400 se ha demostrado que el aumento de temperatura en los tubos de 2 ml es moderado incluso a 30 Hz; una opción sencilla es hacer pausas de más de 1 minuto en las que el adaptador con los tubos se enfría en un baño de hielo durante un minuto. De este modo, la temperatura se mantiene por debajo de 12-15 °C, en función del tamaño de bola utilizado.
Una opción para controlar el desarrollo de la temperatura durante el bead beating es el molino mezclador MM 500 control. Un adaptador especial aloja dieciocho viales desechables de 2 ml por lote. La máquina está conectada a un refrigerador con agua enfriada a 4 °C, que a su vez enfría el adaptador que aloja los viales. De este modo, la temperatura de la suspensión se mantiene a unos 13°C sin las molestas fases de interrupción manual en un baño de hielo. Aunque el control MM 500 no puede funcionar con el adaptador de tubo Falcon desechable, sí puede utilizarse con recipientes de molienda de acero inoxidable con un volumen de 50, 80 o 125 ml (véase el ejemplo de la izquierda: P. pastoris).
Si el molino se utiliza con nitrógeno líquido y el CryoPad y se ajusta a una temperatura de 0 °C, la temperatura de la suspensión celular en tubos desechables de 2 ml puede incluso mantenerse a 0 °C sin congelar la suspensión, lo que permite mantener un bead beating eficaz.
Sistema de medición GrindControl GrindControl muestra lo que sucede dentro del recipiente de molienda, en tiempo real.
GrindControl proporciona visibilidad en tiempo real de los procesos que tienen lugar dentro del recipiente de molienda. La presión y la temperatura se controlan continuamente, lo que garantiza un control seguro y preciso, incluso con materiales sensibles o reactivos. Responda con prontitud a los picos de presión inesperados y vigile de cerca en todo momento las muestras sensibles a la temperatura e incluso las reacciones mecanoquímicas.
GrindControl de un vistazo
- Datos en tiempo real sobre presión y temperatura.
- Detección temprana de afecciones críticas
- Control preciso del proceso
- Protección de materiales sensibles
- Resultados reproducibles
Homogeneización de muestras biológicas blandas y tenaces
Algunas muestras biológicas, como el esputo de pacientes con fibrosis quística o muestras de tejidos como hígado, pulmón o tumores, son a veces más difíciles de homogeneizar por completo. Los tubos desechables de 2 ml suelen ser demasiado pequeños para que entre todo el volumen de la muestra, por lo que hay que dividirla y volver a combinarla después del proceso de homogeneización, lo que añade trabajo y tiempo adicional a la rutina del laboratorio.
Los recipientes de molienda más grandes fabricados en acero inoxidable, por ejemplo, pueden contener todo el volumen de la muestra, pero deben limpiarse después de cada uso. Un adaptador para el molino mezclador MM 400 resuelve este problema al permitir el uso de tubos desechables de 5 x 5 ml, que tienen más capacidad y no necesitan limpiarse. Se pueden homogeneizar simultáneamente 10 muestras por lote. Para la homogeneización de muestras de tejido, también pueden utilizarse tubos Falcon de 50 ml. En este caso, se pueden procesar 8 muestras por lote en sólo unos minutos.
Muestra de hígado antes y después de la homogeneización en el MM 400
Molienda criogénica para la homogeneización de muestras biológicas
Para las muestras pegajosas, como las bayas, la molienda criogénica es a menudo el único método viable para obtener una muestra homogénea. La tabla enumera algunos ejemplos de materiales de muestra que se han procesado con éxito mediante molienda criogénica en el molino mezclador MM 400 o el CryoMill. Para la molienda criogénica en el MM 400 pueden utilizarse recipientes de acero de 2 ml. Es posible conseguir efectos similares en el MM 500 control con recipientes de molienda de hasta 125 ml para volúmenes de muestra mayores. En este caso puede utilizarse el CryoPad para trabajar con nitrógeno líquido. Para volúmenes de muestra más pequeños, también hay disponibles recipientes de acero inoxidable de 2 ml con los adaptadores correspondientes para todos los molinos mencionados.
| Muestra | Accesorios | Cantidad de muestra | Tiempo de molienda | Velocidad | Granulometría final (d90)/ Resultados |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli bacterias |
|
2 x 10 ml pellets celulares congeladas | 2 min | 30 Hz | disrupción celular completa |
| tejido muscular |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | 150 µm |
| agujas de pino |
|
2 agujas por envase | 3 min | 30 Hz | Extracción reproducible de ARN de 20 muestras en un solo paso |
| bayas |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| uñas de los dedos |
|
1 uña por cada vial | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| tripa de rata |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Reliable RNA Detection in Mosquito Surveillance – Efficient, Reproducible, Temperature-Controlled
Surveillance laboratories face a dual challenge: thousands of mosquito pools must be screened for viral RNA every season – rapidly, reliably, and without loss of sample quality. Mechanical homogenization generates frictional heat that irreversibly damages RNA and leads to false-negative PCR results. With the MM 500 control, up to 36 mosquito pools can be homogenized simultaneously at a constant temperature below 15 °C – without a single manual interruption. An aluminium adapter transfers the chiller cooling directly to 18 Eppendorf tubes per grinding station; single-use reaction vessels reliably prevent cross-contamination. Up to 12 stored SOPs standardize the process across the entire season, regardless of the operator.
Recommendations for Practice
Freeze samples immediately after collection, as RNA degradation begins within minutes at room temperature; stainless steel balls (2–3 mm) at 25-28 Hz and 45-60 seconds grinding time have proven effective and can be saved directly as an SOP on the instrument. Laboratories operating under GLP requirements benefit from the optional GrindControl system for seamless real-time documentation of temperature and pressure.
Muestras forenses
Proceso de obtención de células bacterianas intactas a partir de tejido humano
Molinos adecuados para la disrupción celular y la homogeneización de muestras biológicas
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Cell disruption of parasites with Bead Beating
Giardia and Cryptosporidia are parasites which occur in water and can cause diarrhoea in humans. They are persistent forms found in water and are resistant to environmental influences and disinfectants. Detection and quantitative determination of the parasites are typically performed in accordance with ISO 15553 „Water Quality – Isolation and Enumeration of Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts from water“. A German microbiological laboratory has now tested a mechanical approach by using RETSCH’s Mixer Mill MM 400 for bead beating.
Cryogenic Disruption of Yeast Cells
At the Ernst Ruska-Centre-3 (ER-C-3) for Microscopy and Spectroscopy with Electrons, one of the institutes of the renowned Forschungszentrum Jülich, researchers harness the power of cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography to answer important questions regarding the structure and function of biological membranes and membrane-associated protein complexes. To this end, various cellular systems, including yeast, are used as models to study the membrane systems of interest.
Cryogenic disruption of yeast cells according to the Rout Protocol
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Prosthetic joint infections: New method allows for diagnostics of up to 8 samples with high documentation rate
One of the major risks of a joint replacement is prosthetic joint infection (PIJ), a bacterial infection at the interface of implant, tissue, and bone. In 2010, A.-L. Roux et al. published an article titled „Diagnosis of prosthetic joint infection by beadmill processing of a periprosthetic specimen.“ It describes a new diagnosis method of involved microbes, with an impressive documentation rate of more than 83% and, at the same time, a very low contamination rate of 8.7%. The method involves washing the microbes off the tissue samples in a RETSCH Mixer Mill within 210 seconds.
Temperature-controlled preparation of biochemical samples
The temperature plays an important role in biochemical analyses. To ensure that the properties of biological samples are not altered during sample preparation, it is necessary to continuously cool or sometimes even freeze the sample material. This application article describes how the Mixer Mill MM 500 control with its possibilities of temperature-controlled sample processing is used for preparing biochemical samples. As an application example, we present the cell disruption process of a global pharmaceutical and diagnostics company.
What Hair Reveals
The detection of illegal drugs and pharmaceuticals plays a role in various fields, for example in forensic science, road traffic accidents, in competitive sports or at the workplace. Hair has the great advantage of storing the substances for a long period, which means that detection is still possible several months after consumption of the drug. In addition to the detection of drugs, hair samples are also used for DNA analysis as well as for the analysis of heavy metals and minerals.
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Homogenization of tough biological secretions or tissue pieces
Sometimes the preparation and homogenization of biological samples can be as tough as the material itself. The widely used 2 ml single-use Eppendorf tubes are often not large enough to accommodate the whole sample volume; hence, the sample needs to be divided and reunited after the homogenization process which means an additional time-consuming working step in the lab routine. While it is true that usually larger sized grinding jars, e. g. of stainless steel, are available which accommodate the complete sample volume, these have the drawback of requiring cleaning after use.
White Paper: Important Aspects of Sample Preparation of Biological Materials
Biological samples exist in all shapes and sizes: hard bones, tough and fibrous plants, tough and viscous sputum, soft muscles, tumor or liver tissue. Not to mention the millions of cells such as yeast, bacteria or algae, which have to be disrupted for applications such as DNA or RNA isolation or protein extraction. Retsch offers a range of mills and grinders for easy and reproducible pulverization of solid sample materials some of which are also suitable for cell disruption and homogenization of biological sample materials.
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Preguntas frecuentes sobre la disrupción celular y la homogenización de muestras biológicas
¿Qué se entiende por "bead beating" en la disrupción celular?
El bead beating es un método mecánico ampliamente utilizado para la disrupción celular con el fin de extraer componentes celulares de microorganismos como bacterias, levaduras, hongos o microalgas. En esta técnica, pequeñas perlas trituran las células en suspensión, lo que puede llevarse a cabo a distintas escalas con diferentes recipientes y tubos. La automatización que proporcionan los molinos mezcladores RETSCH con adaptadores agiliza el bead beating y garantiza que el proceso sea rápido, eficiente y reproducible.
El tamaño óptimo de las bolitas y los parámetros dependen del tipo de célula y sólo pueden determinarse mediante experimentación. Por ejemplo, el molino mezclador MM 400 puede procesar hasta 20 muestras en viales Eppendorf de 1,5 o 2 ml sin contaminación cruzada. Un adaptador opcional permite alojar hasta ocho tubos Falcon de 50 ml, lo que aumenta aún más la versatilidad del proceso.
¿Cuándo se debe utilizar la molienda criogénica?
La molienda criogénica es indispensable cuando se trata de muestras difíciles que no pueden homogeneizarse en sistemas tampón convencionales. Es el caso, por ejemplo, de plantas fibrosas, venas resistentes, uñas o determinados tejidos animales o tumorales. En esta técnica, las muestras se congelan con nitrógeno líquido antes o durante el proceso de trituración. Esto hace que las muestras se vuelvan frágiles, lo que facilita su trituración en polvos homogéneos.
El proceso de molienda criogénica ofrece importantes ventajas, ya que se conservan las proteínas o los compuestos volátiles que podrían degradarse o evaporarse a temperaturas más elevadas. Además, resulta eficaz para desintegrar orgánulos intracelulares en determinados organismos. Y lo que es más importante, la molienda criogénica es el único método viable para obtener muestras homogéneas de materiales pegajosos como las bayas.
Para obtener resultados óptimos, la molienda criogénica puede realizarse con molinos especiales de laboratorio, como el CryoMill o el molino mezclador MM 400, que pueden alojar recipientes de acero de 2 ml. El molino mezclador MM 500 control, desarrollado especialmente para trabajar con nitrógeno líquido (LN2), admite recipientes de molienda más grandes, de hasta 125 ml.
¿Cómo elegir el molino adecuado para la trituración de muestras forenses como huesos y pelo?
Cuando se trata de pulverizar muestras forenses como huesos o dientes, las trituradoras de mandíbulas o los molinos de corte son la mejor elección para el primer paso del proceso de trituración. RETSCH ofrece una amplia gama de molinos de corte para la trituración previa de una gran variedad de materiales de muestra, incluyendo sustancias blandas, semiduras, elásticas, tenaces y fibrosas. Una amplia gama de accesorios permite adaptar perfectamente estos molinos a las distintas aplicaciones.
El molino de corte versátil SM 300, por ejemplo, cuenta con tres rotores diferentes y tamices de fondo de 0,25 mm a 20 mm, así como una velocidad variable de 100 a 3.000 rpm. Esta flexibilidad lo convierte en una herramienta excelente para adaptarse a las necesidades específicas de procesamiento de muestras forenses.
Para los pasos de procesamiento posteriores, considere la posibilidad de utilizar molinos de bolas equipados con bolas de molienda de más de 5 mm, fabricadas con materiales como acero, óxido de circonio o carburo de tungsteno. Los molinos mezcladores, como el MM 400, son la mejor opción para la pulverización de pelo.